造血干细胞移植为治愈造血、非造血系统良、恶性造肿瘤提供了最有希望的治疗方法，但是发生频率及死亡率很高的并发症—移植物抗宿主病限制了这一治疗方法的应用。去除移植物中T细胞以及免疫抑制药物的使用均不是理想的治疗GVHD的方法。所以人们在寻找能够诱导抗原特异性的移植耐受的方法，在这一过程中发现与移植物同时输入供者CD4~+CD25~+ Treg细胞可以阻止GVHD的发生，促进干细胞植入，并且不减轻GVL效应，为治疗GVHD打开了一扇大门。除了CD25以外，目前还没有发现其他CD4~+CD25~+ Treg细胞特异性表面标志。已有资料显示CD4~+CD25~+ Treg细胞发挥调节作用必须表达CD62L，CD4~+CD25~+ Treg细胞抑制活性也与是否表达CD45相关。CD4~+CD25~+ Treg细胞对CD4~+、CD8~+ T均表现为抑制作用，但是，对NK细胞的作用如何尚不非常明确。而NK细胞在Allo-HSCT中表现两种截然相反的作用，CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞的作用也许会影响CCD4~+CD25~+ Treg细胞在防治GVHD中的应用。本实验通过体外实验初步探讨CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞杀伤活性的影响。我们用Mini-MACS方法纯化健康成人外周血中的CD4~+CD25~+ Treg细胞和NK细胞，可以获得88.7-93.6％的CD4~+CD25~+ Treg细胞，85.6-89.2％的NK细胞。然后我们使用流式细胞仪检测CD62L、CD45在CD4~+CD25~+ Treg细胞表面的表达，发现87.2-90.3％的CD4~+CD25~+ Treg细胞表达CD62L，85.4-88.6％的CD4~+CD25~+ Treg细胞表达CD45。为了探讨CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞杀伤活性的影响，我们将CD4~+CD25~+ Treg细胞或者CD4~+ CD25~-细胞与NK细胞及NK细胞杀伤靶细胞以不同比例混合培养，观察NK细胞杀伤活性，结果发现，CD4~+CD25~+ Treg细胞抑制NK细胞的杀伤活性，CD4~+CD25~-细胞对NK细胞杀伤活性没有明显影响，并且，CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞杀伤活性的抑制表现为剂量依赖。为了探讨CD4~+CD25~+ Treg细胞以何种作用方式作用于NK细胞，我们将CD4~+ CD25~+ Treg细胞放入Transwell培养盘中，以半透膜分隔CD4~+CD25~+ Treg细胞和NK细胞，CD4~+CD25~+ Treg细胞分泌的细胞因子仍然可以通过半透膜作用于NK细胞，结果发现，CD4~+CD25~+ Treg细胞与NK细胞分隔开后对NK细胞的抑制作用不明显。为进一步说明CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞的作用方式，我们使用抗IL-10单抗、抗TGF-β单抗阻断CD4~+CD25~+ Treg细胞通过分泌IL-10、TGF-β发挥作用的途径，观察在这种情况下CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞的作用，结果发现，使用这两种单抗并不能阻止CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞发挥抑制作用，表明CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞的作用不是通过分泌细胞因子的途径实现的。本实验初步探讨了CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞杀伤活性的影响，结果发现CD4~+CD25~+ Treg细胞抑制NK细胞杀伤活性，并且这种抑制作用呈剂量依赖，作用是通过细胞与细胞的直接接触的方式实现的。这一结论为临床应用CD4~+CD25~+ Treg细胞防治GVHD提供了资料，提示在应用CD4~+CD25~+ Treg细胞防治GVHD时，要注意CD4~+CD25~+ Treg细胞对NK细胞有益作用的抑制，避免引起白血病复发率提高、增加感染机会、第二肿瘤发生等问题出现。