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目的 新生血管形成是恶性肿瘤局部侵袭生长和远处转移的必要前提。肿瘤细胞可分泌多种生长因子，打破了体内在正常情况下存在的、血管生成因子和血管生成抑制因子之间的平衡，生成因子浓度上升和/或抑制因子浓度下降，刺激了内皮细胞的增殖、分裂和毛细血管形成。新生血管形成可增加血液灌注，促进肿瘤生长、抑制肿瘤细胞凋亡，使肿瘤易于浸润和转移。抑制肿瘤新生血管形成，可直接阻断对肿瘤的营养和生长因子的供给，也为肿瘤治疗提供新靶点。 TNP-470是一种特异性的血管生成抑制剂。动物实验及临床试验均表明，其对多种肿瘤组织的生长与转移有抑制作用。从不同水平对TNP-470的作用机制研究的结果认为，TNP-470抑瘤机制主要与其抑制肿瘤血管生成有关。本实验用体外培养的人脐静脉内皮细胞和肺癌细胞株，探讨TNP-470对肿瘤细胞诱导的内皮细胞增殖的影响及其机制，并联合应用TNP-470与IL-2探讨二者联合用药的效应。 方法 采用改进的Jaffe法培养人脐静脉内皮细胞（HUVEC）及传代培养肺癌细胞株AZGY82A。待细胞达到亚融合状态后，制备肿瘤细胞条件培养液和细胞粉碎液。将HUVEC分组：正常对照组（仅加培养液）；条件对照组（仅加肿瘤细胞条件培养液或细胞粉碎液）；TNP-470组(TNP-470浓度分别为：10-12、10-10、10-8、10-6g/ml)；IL-2组（1000IU/ml）；联合应用组(10-8g/ml TNP-470+1000IU/ml IL-2)。用免疫细胞化学方法检测内皮细胞PCNA、 VEGFR－2／Fib一＊FGFR的表达，采用阳性细胞计数法及图像分 析法对结果进行分析。用流式细胞分析仪对内皮细胞的细胞周期 进行分析。 结 果 在10－’‘－10一矿M范围内，TNP－470以剂量依赖方式抑制 肿瘤细胞条件培养液或细胞粉碎液诱导的内皮细胞PCNA的表达 (与正常对照组比较P＜o．05人 以IL一2作用后，内皮细胞表达 PCNA的阳性率亦降低，但与TNP－470联合应用时，其效应并不 强于TN P一47o或IL－2单独应用（P＞o．05）。TN P－47o作用于 亚融和状态的内皮细胞后，G／Gl期内皮细胞的百分率增加十期 内皮细胞的百分率降低；IL－2作用后下期内皮细胞的百分率降 低；TNP－470与IL－2联合应用时，G／G；期内皮细胞的百分率增 加卢期内皮细胞的百分率降低。TNP—470以剂量依赖方式抑制 癌细胞条件培养液诱导的＊＊＊＊C FibFlk－1的表达(P＜O．05人随 TNP－470浓度升高，肿瘤细胞粉碎液刺激的内皮细胞FGFR表达 的阳性率逐渐下降沙＜o．05人 讨 论 肿瘤的生长和转移具有血管依赖性。在体内，肿瘤的血管新 生刺激因子主要来源于肿瘤细胞，其中VEGF、FGFS是主要的正 性调节因子。VEGr是一种分泌型糖蛋白细胞因子，可由肿瘤细 胞释放，特异地作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞的增殖。在体 外，VEGF主要存在于培养肿瘤细胞的条件培养液中。而FGFs是 一种非分泌型生长因子，存在于细胞的胞浆和／或胞膜两侧，有强 的促进血管内皮细胞增殖的作用。在体外，FGF可存在于培养肿 瘤细胞的粉碎液中。应用肿瘤细胞条件培养液或细胞粉碎液刺激 培养的血管内皮细胞，更接近于体内环境。本实验中观察到，肿瘤 ·2·细胞条件培养液或细胞粉碎液刺激后，内皮细胞PCNA表达明显增强。这表明，肿瘤细胞条件培养液或细胞粉碎液均可促进内皮细胞增殖。 TNP－470是一种人工合成的烟曲霉素衍生物，它能以一种相对特异的方式抑制内皮细胞生长。尽管大量动物实验及临床试验均观察到它可以抑制多种肿瘤的生长，但其作用的具体机制尚未完全阐明。本实验观察到，应用TNP－470作用后，肿瘤细胞条件培养液或细胞粉碎液诱导的内皮细胞PCNA表达减弱，且呈剂量依赖方式；与条件对照组比较，TNP－470作用后，GO／G；期细胞百分率升高后期细胞百分率减少。此外还发现，TNP－470可使肿瘤细胞诱导的内皮细胞VEGF受体一2（VE硼一2／i一门和FGF受体订GFR）表达减少。因此推测，TNP－470可能是通过降低内皮细胞表面生长因子受体的表达，减弱了酪氨酸激酶受体介导的内皮细胞增殖，进而发挥其抑制血管新生的作用的。 IL—2是近年在肿瘤免疫治疗方面应用较广的细胞因子，其在体外可诱导细胞周期的改变。本实验应用流式细胞仪分析观察了TNP－470和IL－2对内皮细胞周期的影响，结果发现，虽然TNP－470与 IL－2均能抑制内皮细胞进人 S期，但两者联合应用的效应并不强于TNP－470或IL－2的单独应用。此外，1000IU／nl IL一二单独作用于肿瘤粉碎液刺激的内皮细胞24小时后，可见在G／Gl峰前有一明显的亚 G／G；峰，这可能与高浓度 IL－2长时间作用能引起细胞毒效应有关。 肿瘤新生血管形成是受多因素、多步骤控制的。本研究表明，TNP－470能够抑制肿瘤细胞诱导的内皮细胞增殖，它可能主要经降低内皮细胞表面Fib—l