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盐度是影响刺参Apostichopus japonicus养殖中最常见的非生物因素,是限制刺参养殖行业稳定发展的主要因素。低盐胁迫是刺参养殖过程中经常面临的问题,为了更好地提高刺参养殖业的经济效益和社会效益,研究刺参在低盐下的适应机制是不可或缺的。微小RNA(miRNA)是长度为18~25个核苷酸的内源性非编码小RNA,在生物体的生命活动过程中具有调节功能,通过转录后抑制靶基因mRNA的翻译或降解mRNA从而起到响应环境影响的作用。本研究课题组构建了刺参各组织在18 psu处理6h的小RNA文库和转录组cDNA文库并进行了高通量测序,获得了差异表达的miRNAs和靶基因,并对其靶基因进行了预测。本研究在高通量测序中获得的刺参盐度胁迫相关miRNAs和靶基因的基础上,从中选取3个miRNA(miR-2008、miR-278-3p、miR-92a)及对应的靶基因,通过对其在体外和刺参体内的表达模式进行分析,获得miRNA及靶基因在刺参盐度胁迫过程中发挥的作用,为刺参的盐度适应机制提供数据支持。研究成果如下:(1)从刺参盐度胁迫后的转录组数据库表达谱中筛选出4个差异表达的基因,包括:单羧酸转运蛋白家族16a13基因(SLC16a13),单羧酸转运蛋白家族6a8基因(SLC6a8),甲壳素受体蛋白基因(FIBCD1),AMPA型谷氨酸受体1基因(Grial)。qRT-PCR技术检测在刺参受到低盐胁迫后1.5、3、6、12、24、48和72h的肠、呼吸树、体腔细胞的表达情况。结果表明,SLC16a13、SLC6a8、FIBCD1、Grial基因在同一胁迫时间点不同组织中具有组织差异性,同一个组织在不同胁迫时间点时表达量具有时序性。(2)在原代培养的刺参体腔细胞中,导入miR-2008模拟物(agomir),通过qRT-PCR检测过表达情况。结果如下,在阴性对照agomir NC组中和agomir 2008处理组中,miR-2008和靶基因PLEKHA3的表达量在不同胁迫时间点存在差异。在相同胁迫时间点不同处理组下,分别以每个时间点的agomir NC作为对照组,miR-2008的表达量在0 h(未进行盐度胁迫)、6 h的刺参体腔细胞中上调,与agomir NC相比,分别是差异极显著(P<0.01)和差异显著(P<0.05),靶基因PLEKHA3的表达量下调,与对照组agomir NC相比差异显著(P<0.05),miR-2008及靶基因PLEKHA3呈现负向调控的关系。随着胁迫时间增长,miR-2008及靶基因PLEKHA3的调控关系发生变化,24 h的体腔细胞中,miR-2008及靶基因PLEKHA3的表达量与对照组agomir NC相比差异不显著(P>0.05),48 h的体腔细胞中,miR-2008的表达量下调,与对照组agomir NC相比差异显著(P<0.05),PLEKHA3的表达量下调,与对照组agomir NC相比差异显著(P<0.05)。(3)将miR-2008模拟物(agomir 2008)注射到刺参体内24 h后进行低盐胁迫。结果显示,在刺参体内注射miR-2008模拟物和阴性对照序列,miR-2008和PLEKHA3的表达量在不同盐胁时间点存在差异。在低盐胁迫阶段,miR-2008的表达量上调,PLEKHA3的表达量下调,miR-2008及靶基因PLEKHA3呈现负向调控的关系。(4)将靶基因PLEKHA3的干扰试剂(SIPLEKHA3)注射到刺参体内24 h后进行低盐胁迫,靶基因PLEKHA3和miR-2008的表达情况。结果显示,在阴性对照组SINC中,PLEKHA3在低盐胁迫24h、48h的表达量与其它时间点相比差异显著(P<0.05),miR-2008在低盐胁迫6h、24h、48 h的表达量与0h的表达量相比差异显著(P<0.05);在靶基因干扰组(SI)中,PLEKHA3的表达量在低盐胁迫6 h的表达量显著高于其它时间点,miR-2008在低盐胁迫时间点的表达量与0 h相比差异显著(P<0.05)。分别以每个时间点的SINC作为对照组,靶基因PLEKHA3在0 h(未进行低盐胁迫)的表达量下调,miR-2008的表达量下调,与对照组相比差异均极显著(P<0.01),在6 h,PLEKHA3的表达量与对照组差异不显著,miR-2008表达量上调,与对照组差异显著(P<0.05),PLEKHA3的表达量在24h下调,与对照组相比差异显著(P<0.05),miR-2008下调,与对照组差异显著(P<0.05),PLEKHA3的表达量在48 h差异不显著,miR-2008上调表达,与对照组相比差异显著。在活体水平上进行PLEKHA3干扰,测定胁迫后每个时间点的ROS,结果表明,在正常盐度阶段,刺参ROS不受干扰影响,在低盐胁迫阶段,每个时间点ROS与对照组相比,都是显著性差异。在6h时间点,ROS上升,在24 h时间点,ROS下降,在48 h时间点,ROS上升,与SI干扰后低盐胁迫下靶基因PLEKHA3的表达趋势是一致的。在活体水平上进行PLEKHA3干扰,测定刺参体腔液上清的渗透压、离子浓度、酶活,结果表明,干扰组的测定结果不同于与阴性对照。(5)将miR-92a模拟物(agomir 92a)和抑制物(antagomir 92a)导入到刺参体腔细胞内24h后进行低盐胁迫。结果显示,在刺参体腔细胞中分别导入miR-92a模拟物、抑制物(antagomir 92a)和阴性对照序列,miR-92a和PLSCR2的表达量在不同盐胁时间点存在差异。分别以每个时间点的agomir NC作为对照组,miR-92a在非低盐胁迫0h的表达量上调,且与对照组相比,差异极显著(P<0.01),在盐胁阶段的每个时间点都上调,与对照组相比,差异显著(P<0.05)。靶基因PLSCR2在24h、48h表达下调,与对照组相比,差异显著(P<0.05)。分别以每个时间点的antagomir NC作为对照组,miR-92a的表达量下调,靶基因PLSCR2在0、24h的表达量下调,与对照组相比,差异显著(P<0.05),在48 h上调表达,与对照组相比差异显著(P<0.05)。(6)将miR-278-3p模拟物(agomir)和抑制物(antagomir)导入到刺参体腔细胞内24 h后进行低盐胁迫。结果显示,在刺参体腔细胞中分别导入miR-278-3p模拟物、抑制物(antagomir)和阴性对照序列,miR-278-3p和Htr2b的表达量在不同盐胁时间点存在差异。分别以每个时间点的antagomirNC作为对照组,miR-278-3p在非盐胁0h表达下调,说明miR-278-3p抑制物起作用,24h表达上调,靶基因Htr2b在0h(非盐胁)的表达量下调,在6、24、48h上调表达。敲减miR-278-3p的表达,miRNA在非盐胁阶段表达下调,靶基因表达下调,两者关系是正相关。