第一部分RMP促进肝癌细胞转移的作用与机制研究研究背景和目的原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一,我国是原发性肝癌的高发地区,每年约有全球一半的新发病例发生在我国。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原发性肝癌中常见的病理类型,所占比例约为70%-85%。目前手术切除是原发性肝癌治疗的首选治疗方式。但是原发性肝癌手术切除后的高复发率仍然是导致肝癌患者预后不佳的主要原因。因此研究肝癌的发病机制显得尤为重要。目前,大家比较公认的是肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)理论,该理论认为肝癌最初是由一部分具有自我更新能力的肿瘤起始细胞(tumor-initiating cells,T-ICs)或称为肿瘤干细胞所导致的。T-ICs具有以下特征：1,自我更新能力；2,分化能力；3,肿瘤形成能力；4,放化疗抵抗能力。因为T-ICs具备这些特征导致了肝癌的转移和复发。基于此理论,有研究这认为,T-ICs的激活是由于某些癌基因或其影响的信号通路的激活所导致的。因此,寻找影响肝癌肿瘤起始细胞的关键分子和信号通路对肝癌今后的治疗有着深远的影响。RMP (RPB5-mediating protein)是RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ, RNAPⅡ)第5亚基的调节蛋白,又名C19orf2或URI。最早是采用Far-Westen印迹发法,以32P标记的重组人RPB5探针从肝癌细胞株cDNA文库中筛查得到。随后发现RMP在基因转录、细胞凋亡、基因组稳定以及肿瘤发生发展中均起到重要作用。有报道称,RNA聚合酶Ⅱ第五亚基(RNA polymerase Ⅱ subunit5,RPB5)是乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)和转录因子IIB(general transcription factor IIB,TFIIB)的结合蛋白,提示RPB5可能是一个调节RNA聚合酶Ⅱ转录活性的基团。RMP在体内、外可以结合RPB5,并且在HBx的转录中起到抑制性作用。除此之外,RMP还可以结合TFIIF作为补充途径来调节转录活性。另有研究组发现RMP/URI主要参与mTOR依赖的营养代谢的转录调控。S6kinase1(S6K1)是一个可以定位在线粒体上的蛋白激酶,既参与生长信号通路,也参与营养信号通路的调节。S6K1可以磷酸化,促凋亡蛋白BAD,使其灭活。营养缺乏情况下,RMP/URI可以与PP1γ在线粒体上形成复合物,抑制PP1γ的活性。在生长因子刺激的情况下,可以释放PPly,使BAD去磷酸化,发挥促进凋亡的作用,负性调节S6K1所介导的生存信号。以上研究结果显示RMP可以促进肿瘤形成和发展,抵抗放化疗的损伤。目前关于RMP对肝癌起始细胞/肝癌干细胞的调节作用并未见报道。而我们前期预实验结果提示,RMP在人类肝癌组织样品中表达水平明显升高,并且RMP在具有自我更新能力的spheroid细胞中表达水平明显高于贴壁生长的肝癌细胞。这些结果均提示RMP可能在肝癌的起始细胞/肝癌干细胞中发挥着重要作用。在本研究中,我们将首先检测肝细胞癌细胞系中和临床样本中RMP的表达情况,分析其表达变化与患者临床病理资料关系。利用慢病毒感染系统稳定干扰RMP的细胞系,进一步观察RMP对肝癌细胞自我更新能力及转移的影响。同时阐明RMP调节肝癌细胞转移的具体分子机制。实验方法：1.在转移能力不同的肝癌细胞系中SMMC7721,Huh7, MHCCLM3和高转移能力肝癌门静脉癌栓细胞系CSQT-2中,应用Western blot和定量PCR的方法在蛋白水平和mRNA水平检测RMP的表达；2.在原发性肝细胞癌患者的门静脉癌栓,肝癌及癌旁组织中,应用Western blot和定量PCR的方法在蛋白水平和mRNA水平检测RMP的表达；3.构建慢病毒干扰系统,稳定干扰肝癌细胞系中RMP的表达,然后应用transwell观察细胞的体外转移能力,应用裸鼠经尾静脉肺转移模型和经脾脏肝转移模型观察细胞的体内转移能力；4.应用低粘附板进行成球实验,观察差异表达RMP的细胞对自我更新能力的影响；5.应用定量PCR方法检测差异表达RMP的细胞干性相关基因,肝癌干细胞表面标志物及EMT相关基因的表达；6.应用Western blot方法检测差异表达RMP的细胞影响的主要信号通路；7.用人白细胞介素-6ELISA试剂盒和定量PCR方法在蛋白水平和mRNA水平检测差异表达RMP的稳转细胞系其白细胞介素-6的表达；8.应用IL-6的封闭抗体和小RNA干扰两种方法中和IL-6的作用检测差异表达RMP的细胞系干性相关基因的表达以及转移能力的改变；9.应用免疫共沉淀(IP)的方法检测RMP与p65、RPB5等蛋白的相互作用；10.应用染色质免疫共沉淀(CHIP)的方法检测差异表达RMP的细胞中,p65与白细胞介素-6启动子区结合的能力。结果：1.RMP在肝癌细胞系中的表达：RMP的表达与肝癌细胞的转移能力密切相关,在转移能力低的SMMC7721细胞中RMP的表达最低,在转移能力最高的CSQT-2细胞中RMP的表达最高；2.RMP在临床样本中的表达：在肝癌临床样本中,门静脉癌栓样本的RMP表达最高,肝癌样本表达次之,癌旁组织的表达最低；3.RMP对肝癌细胞转移能力的影响：在肝癌细胞系中稳定干扰RMP的表达可以明显抑制肝癌细胞的迁移和侵袭的能力,体内实验提示,干扰RMP的表达明显抑制了肝癌细胞的体内转移能力；4.RMP对肝癌细胞自我更新能力的影响：干扰掉RMP的表达可以明显抑制肝癌细胞的自我更新能力,过表达RMP可以增强肝癌细胞的自我更新能力；5.RMP对肝癌细胞干性相关基因的影响：干扰RMP的表达明显抑制了肝癌细胞中部分干性相关基因的表达,过表达RMP可以明显增加部分干性相关基因的表达；6.RMP调节肝癌细胞的主要信号通路：干扰RMP主要影响肝癌细胞IL-6-STAT3信号通路的活性；7.RMP对肝癌细胞IL-6水平的影响：在肝癌细胞中干扰RMP的表达在蛋白和mRNA水平抑制了IL-6的分泌,过表达RMP也明显的增加了IL-6的表达；8.RMP影响肝癌细胞自我更新和转移是通过IL-6：中和IL-6的作用明显抑制了由于过表达RMP产生的促进肝癌细胞转移的能力；9.RMP调节p65转录活性的具体机制：RMP通过RPB5与p65相互作用,调节p65的转录活性,促进IL-6的转录；10.RMP调节IL-6转录的机制：在没有RMP的情况下,肝癌细胞p65结合到IL-6的启动子区的能力明显下降。结论：本实验首先在临床样本中发现RMP的表达与门静脉癌栓关系密切。在细胞水平发现RMP蛋白能够促进肝癌细胞的转移和自我更新能力。进一步探索发现RMP促进肝癌细胞的转移是通过影响肝癌细胞自身分泌的IL-6,从而影响IL-6/STAT3信号通路。具体影响IL-6表达的分子机制是,RMP可以促进p65结合至IL-6的启动子区,促进IL-6的转录水平。第二部分RMP判断原发性肝细胞癌预后及评估术后TACE疗效的研究研究背景和目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma)是世界最常见的恶性肿瘤之一,每年将近500,000的人死于肝癌。口前肝切除和肝移植被认为是治疗肝癌的有效手段。但是由于缺少足够的肝源,肝切除才是肝癌患者主要的治疗方式。但是约有一半的患者术后五年内会复发,即使是小肝癌也有40%的患者五年内复发。因此术后复发和转移是影响肝癌预后的主要因素。肝癌的术后复发通常发生在术后的6-12个月。目前比较公认的是,肝癌手术切除术后较长时间的复发可能是源于多中心肿瘤的生长,而术后短时间内就复发则多是因为肝内的转移。这种转移灶可能很难在术前或者是术中发现,还有可能是手术残留或者是由于手术挤压导致肿瘤的播散。经导管动脉的栓塞化疗(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)是我国最常用的用来治疗不可切除肝癌的方法。目前也被认为是预防肝癌术后复发的主要方法。肝癌切除术后的TACE主要的作用是抑制残余肿瘤的生长和早期发现微小的转移病灶。有报道称,与全身化疗相比,TACE可使肿瘤局部的化疗药物浓度提高10-100倍。因为供应肿瘤的血供在栓塞的作用下大幅降低,因此,化疗药物可以更长时间的作用于肿瘤组织。然而在中国,患者通常具有乙肝病毒感染和肝硬化背景,术后的TACE还有可能损伤残余肝的肝功能。所以,对于肝癌术后患者是否均应该接受TACE治疗。尚存争议。肉眼癌栓,微血管癌栓及肝内转移均是肝癌术后复发的危险因素。这类患者通常是应该接受术后TACE的治疗。那么,除了这些病理特征外,是否有更为准确的分子分型来指导我们术后]TACE的应用?这个问题,目前尚待证实。我们前期的实验结果显示,RMP与肝癌细胞的转移密切相关,这提示RMP高表达的肝癌细胞可能具备较高的转移能力。因此我们推测RMP可能作为肝癌患者判断预后的标志及评估肝癌术后TACE疗效的标志。实验方法：1.运用免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)检测肝癌患者手术切除术后的组织切片中RMP的表达；2.应用免疫组织化学评分系统(German immunoreactive score,IRS)对其进行组化评分；3.统计分析实验结果和临床病理资料,明确RMP与肝癌患者预后的关系。结果：1.RMP在肝癌组织样本中的免疫组化结果：免疫组织化学方法显示RMP主要表达与肿瘤的细胞浆,部分患者细胞核也有表达；2.RMP的免疫组化评分结果：免疫组织化学评分结果显示RMP在肝癌患者中多数呈现高表达状态；3.RMP与肝癌患者预后的关系：肝癌组织患者中,高表达RMP者预后较低表达RMP者差,但高表达RMP患者对肝癌术后TACE的反应性更好。结论：本研究发现RMP在肝癌组织中表达升高,其表达与肝癌患者性别,肿瘤大小,门静脉癌栓侵犯,BCLC分期、TNM分期和术后生存期相关。高表达RMP患者术后生存期更短。但在高表达RMP的患者中,术后的TACE可以明显的提高患者的总体生存期；而低表达RMP的患者整体生存情况较好,术后的TACE并不能提高患者的总体生存时间。这为肝癌患者术后是否需要行TACE预防肿瘤复发提供了可靠的分子标志物。