研究背景：　　 脓毒症(sepsis)是许多疾病的共同病理生理过程,是指感染引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),其本质是大量细胞因子和炎症介质释放导致的宿主自身免疫性损伤(host autoimmunityiIliury)。脓毒症发病因为多样,发病机理复杂,死亡率较高。许多研究表明其发病早期即已发生多个器官的组织损伤,进一步发展可引起严重脓毒症(severesepsis)、脓毒性休克(septic shock)、多器官功能障碍综合征(multiple organdysfunction syndrome,MODS)甚至死亡。尽管近些年来对脓毒症进行了大量研究,对其认识也逐步加深,但其发病率、死亡率仍然居高不下,成为ICU中病人死亡的首位疾病,且住院时间长、治疗花费巨大。在美国,估计每年有21万人死于脓毒症,而在我国目前尚无这方面的统计数字。脓毒症的发病机制十分复杂,其病理生理过程主要包括:细胞因子风暴、炎症介质瀑布、肠道细菌移位和肠源性内毒素血症、凝血系统和炎症系统的交互作用、以及微循环和线粒体功能障碍等。　　 目前关于脓毒症的研究很多,但尚有很多未解决的问题,例如:在脓毒症早期这一治疗的最佳和关键时期内,器官的结构和功能是否受到损伤、损伤程度和性质如何?其病理生理及功能发生什么变化?其损伤程度与脏器功能障碍有何关系?其损伤规律和机制如何?如何对其损伤进行早期干预、防止脓毒症的进展和MODS的发生?本研究的目的是基于上述对脓毒症的认识和尚待解决的问题,通过实验研究探讨凋亡细胞和坏死细胞对脓毒症的影响及其机制,从而为今后治疗方法的探索提供新的方向,为早期干预方法的研究提供实验参考。　　 一、C57BL,6小鼠与BALB/C小鼠脓毒症模型的建立及其反应性差异的分析　　 目的：建立小鼠脓毒症模型,分析C57BL/6与BALB/c两品系小鼠对脓毒症反应的差异性,从而为本实验选择合适的用于脓毒症模型的小鼠。　　 方法:1.SPF级C57BL/6小鼠30只,SPF级BALB/c小鼠33只,进行随机分组,分组情况具体如下:(1)用于生存率分析的共43只:C57BL/6 Sham组10只,C57BL/6 CLP组10只,BALB/c Sham组10只,BALB/c CLP组13只；(2)用于细胞因子检测的共20只:C57BL/6 Sham组5只,C57BL/6 CLP组5只,BALB/c Sham组5只,BALB/c CLP组5只。　　 2.用盲肠结扎穿孔法(CLP)建立小鼠脓毒症模型。Sham组常规消毒腹部,皮肤正中切开,打开腹腔寻找盲肠,找到盲肠后不进行盲肠结扎、穿孔,将其放回腹腔,然后关闭腹腔,逐层缝合；CLP组常规消毒腹部,皮肤正中切开,打开腹腔寻找盲肠,小心分离其远端与结肠的系膜,避免碰伤肠系膜血管。盲肠内如有粪便,则轻轻将其挤向与其相连的结肠,在盲肠远端3/4处用无菌4号丝线紧紧结扎,并用无菌7号针头在已结扎盲肠远端中央处贯通穿刺,然后把盲肠推回腹腔,关闭腹腔,逐层缝合。所有动物均在术后立即行液体复苏治疗,即经背部皮下注射生理盐水(50ml/kg)。整个实验过程在室温22～25℃的环境中进行,并让小鼠自由饮食、饮水。本实验根据汤耀卿等人提出的脓毒症动物模型必须具备的基本要素判断造模是否成功。术后6小时,从各组小鼠中随机选出5只小鼠,均行去眼球取血,而后将所取外周血离心并收集上清。应用Bio-Plex悬浮蛋白芯片系统及小鼠8因子检测试剂盒检测不同上清中细胞因子的浓度。其余43只小鼠用于生存率分析。　　 结果:1.造模成功(1)C57BL/6和BALB/c两种小鼠的死亡率分别为50％和90％,符合脓毒症高死亡率的特点；(2)观察到多脏器的病理损伤改变及呼吸急促、少尿等变化,可提示多器官功能障碍；(3)小鼠死亡均发生在12小时后。以上结果符合脓毒症模型必须具备的基本要素,因此可以认为成功建立了小鼠脓毒症模型。　　 2.两种小鼠反应性的差异(1)C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠术后状态CLP术后24小时内,C57BL/6小鼠活动较少,神情倦怠,眼角出现大量白色分泌物,饮食饮水减少,腹腔有较多渗出液；而BALB/c小鼠活动正常,神志尚好,眼角未见白色分泌物,饮食饮水正常,腹腔有少许渗出液。两品系Sham组小鼠状态均较好,饮食饮水正常,无腹腔渗出液。(2)小鼠术后1周存活率 术后1周,Sham组BALB/c小鼠与C57BL/6小鼠均无死亡,存活率均为100％；CLP组BALB/c小鼠存活8只,死亡5只,存活率为53.8％；CLP组C57BL/6小鼠存活1只,死亡9只,存活率为10％。采用生存分析中的Kaplan-Meier法分析显示:CLP术后,C57BL/6小鼠1周生存率明显低于BALB/c小鼠(P<0.05)。　　 结论:C57BL/6 与BALB/c两种小鼠对脓毒症的反应能力有差异,C57BL/6小鼠反应更敏感,但是二者均适用于造脓毒症模型。因此,可以根据实验目的从两种小鼠中任意选择一种作为下一步实验的实验动物即可,我们选用的是BALB/c小鼠。　　 二、凋亡和坏死细胞输注对脓毒症小鼠存活率的影响　　 目的：探讨凋亡和坏死细胞对脓毒症小鼠存活率的影响,从而为脓毒症的免疫治疗提供新的方向。　　 方法:1.制备凋亡和坏死细胞(1)制备胸腺细胞悬液并调整细胞悬液浓度为5×106个/ml(2)取直径为6cm的培养皿,加入4ml细胞悬液,而后再加入Dex处理并调整Dex终浓度为5×10-6。置于37℃,5％CO2细胞培养箱中培养6小时诱导胸腺细胞凋亡。(3)取离心管,加入4ml细胞悬液,将离心管置于56℃水浴锅中恒温加热60min,诱导胸腺细胞坏死。　　 2.BALB/c小鼠90只,随机分为PBS组、凋亡细胞组和坏死细胞组,每组30只,分别给小鼠经阴茎静脉输注无菌PBS或者浓度为2.5×108个/ml的凋亡细胞或坏死细胞,输注体积为每只小鼠200ul。于输注细胞后的第三日行盲肠结扎穿孔术(CLP)。术中由于麻醉或手术等因为,PBS组死亡1只,凋亡细胞组死亡3只,将这些小鼠剔除出实验观察的对象中,最终进入实验观察的小鼠共86只,术后观察并记录小鼠1周存活率。　　 结果:1.地塞米松诱导的胸腺细胞凋亡的凋亡率为(64.152±1.841)％(n=4),水煮法(56℃)诱导的胸腺细胞坏死的坏死率为(95.247±3.977)％(n=4)。　　 2.术前三日输注PBS、凋亡细胞或坏死细胞,小鼠术后1周存活率分别为:,PBS组为46.7％(n=29)、凋亡细胞组76.7％(n=27),坏死细胞组为26.7％(n=30)。采用生存分析中的Kaplan-Meier法分析显示:CLP术后小鼠1周生存率,凋亡细胞组明显高于坏死细胞组和PBS组,坏死细胞组明显低于PBS组(P<0.05)。　　 结论:术前三天输注凋亡细胞能提高脓毒症小鼠存活率；而输注坏死细胞则降低脓毒症小鼠存活率。　　 三、凋亡和坏死细胞影响脓毒症小鼠存活率的机制　　 目的：观测凋亡和坏死细胞对脓毒症小鼠器官损伤及免疫系统的影响,从而探讨凋亡细胞和坏死细胞影响脓毒症小鼠存活率的机制。　　 方法:1.将20只BALB/c小鼠随机平均分为4组:第一组为Sham组、第二组为PBS组、第三组为凋亡细胞组、第四组为坏死细胞组。不给第一组小鼠输注任何物质；给第二组小鼠经阴茎静脉输注200ul无菌PBS；给第三组小鼠经阴茎静脉输注2.5×10。个/ml×200ul凋亡细胞；给第四组小鼠经阴茎静脉输注2.5×108个/ml×200ul坏死细胞。　　 2.(1)于输注细胞后的第3日给小鼠行CLP术,未输注任何溶剂的Sham组则行Sham术。(2)检测术后6小时及12小时小鼠外周血中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、GM-CSF、IFN-γ和TNF-αt的浓度及ALT、TBil、Cr、CK、LDH和Samy的水平。(3)观测术后12小时各组小鼠的肺组织病理改变。　　 结果:1.检测小鼠术后6小时及12小时外周血中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α的浓度发现各组间无显著性差异(P>0.05)。　　 2.检测小鼠术后12小时外周血中ALT、TBil、Cr、CK、LDH和Samy的水平发现各组间无统计学差异(P>0.05)。　　 3.观测术后12小时各组小鼠的肺组织病理改变得知,Sham组肺组织基本正常,而应用PBS预处理3天后行CLP,其肺组织呈现明显的炎症表现,如水肿、渗出和大量的白细胞浸润,而应用凋亡细胞预处理3天后行CLP,则肺部炎症明显降低,相反,应用坏死细胞预处理3天后行CLP肺部炎症更进一步加重,提示凋亡细胞预处理能减轻肺组织的炎症损伤,而坏死细胞预处理加重肺组织的炎症损伤。肺的损伤程度与动物存活有密切关系,提示肺部损伤是CLP脓毒症的主要死亡因为。由于凋亡细胞或坏死细胞输注后均会首先经过肺,提示凋亡细胞或坏死细胞对CLP小鼠存活率的影响是通过其对肺组织炎症的降低或加重而实现的。　　 结论:凋亡细胞对脓毒症小鼠有保护作用,而坏死细胞则会加重脓毒症小鼠的损伤。早期脓毒症的器官损伤主要是肺损伤,凋亡细胞或坏死细胞可以通过减轻或加重肺的炎症损伤来影响动物的存活。