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植物病害是导致农作物减产的重要因素,目前采用的化学防治方法已引起环境污染等一系列负面效应,利用微生物产生的抗菌素防治植物病害具有对环境友好、能克服环境因子影响等优点,在植物病害防治中起着越来越重要的作用。分离自番茄茎内的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)B47菌株,能产生抑制包括玉米小斑病菌(Bipolarismaydis)在内的多种植物病原菌的拮抗物质。本文在优化B47菌株高产抗菌物质的培养基和发酵条件,以获得大量抗菌物质的基础上,对B47菌株的抗菌物质进行纯化和鉴定,测定拮抗物质的理化性质、在玉米叶片上的作用方式、残留期和持效期及其对玉米小斑病的防治效果,为B47菌株抗菌物的研发和应用提供理论基础,同时为玉米小斑病的防治提供新途径。主要研究结果如下:
1.B47菌株高产抗菌物质的最佳碳、氮源和无机盐分别为蔗糖、酵母浸膏和MgSO4·7H2O,通过正交试验法得到最优培养基配方为:蔗糖2％,酵母浸膏2％,牛肉浸膏1.5％,MgSO4·7H2O0.06％,FeSO4·7H2O0.0009％。该培养基的营养组分和含量与已报道的培养基不同,将其命名为YSB(YeastExtract-Sucrose-BeefExtract)培养基。经比较发现,B47菌株在YSB培养基中培养,其抗菌物质的产量均显著高于常用培养基NB、LB、BPY和KMB。
以YSB为培养基,在确定单因子的基础上,通过正交试验法对B47菌株高产抗菌物质的发酵条件进行优化,得到最优发酵条件组合为:30℃,pH7.0,170rpm振荡培养6d,接种量为1％,装液量为40mL/200mL培养瓶。
2.经盐酸沉淀、甲醇萃取、硅胶柱层析、分子凝胶过滤层析和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等方法从B47菌株的无菌发酵液中提取和纯化到一种对玉米小斑病菌具有较强抑制作用的活性物质。纯化物的双缩脲反应呈阳性,茚三酮反应呈阴性,但水解后呈阳性,推测其分子为环状结构的肽类物质。红外吸收光谱扫描结果表明该物质分子构成中存在酰胺键的官能团N-H、C=O和C-N及脂肪碳链中的官能团C-H,表明纯化物是一种脂肽类物质。氨基酸组分分析得到纯化物的氨基酸种类和摩尔比约为Tyr:Pro:Ser:Glx:Asx=1:1:1:1:3,与已知的脂肽化合物iturinA的氨基酸组成相似。MALDI-TOF-MS/MS质谱分析得纯化物的分子量为1042Da。MALDI-TOF-MS/MSCID质谱分析得纯化物的分子一级结构为Pro-Asn-Ser-βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln,其分子量和一级结构均与iturinA2相同,将该物质鉴定为脂肽化合物iturinA2。
3.对脂肽化合物iturinA2的理化性质进行测定,试验结果表明,iturinA2的热稳定性好,100℃处理30min后,活性没有变化;经121℃高压处理20min后,活性仍为对照的90.45％。iturinA2的光(紫外线)稳定性好,经紫外灯(40W、10cm)照射8h及阳光照射15d,其抑菌活性没有变化。此外,该物质对蛋白酶K、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶稳定。iturinA2在中性或碱性条件(pH7-10)下较稳定,在酸性条件(pH3-6)下不稳定;能溶于甲醇、磷酸缓冲液和水,不溶于乙醇、丙酮、乙腈、苯、乙醚和三氯甲烷;在常温和4℃下保存18个月时,其抑菌活性仍保持原有活性的77.04％和75.77％,说明iturinA2的自然降解速度较缓慢。
抑菌谱试验发现,iturinA2对测试的14种病原真菌有抑制作用,其中,对玉米大、小斑病菌和两种香蕉叶斑病菌的抑制作用最强,对测试的细菌无抑制作用,说明iturinA2具有广谱的抗真菌能力,对我国南方多种植物病害具有防治潜力。
4.通过抑制菌丝生长法得到iturinA2对玉米小斑病菌的抑制中浓度(EC50)为8.8024mg·L-1。在离体、小区和田间条件下测试iturinA2防治玉米小斑病的效果,发现iturinA2对玉米小斑病的防治效果随使用浓度的增加而增加。在室内离体防治试验中,iturinA2的使用浓度为300mg·L-1时,防治效果为100％,显著高于B47菌液和百菌清的防治效果;当其浓度分别100mg·L-1和50mg·L-1时,其防治效果分别为67.33％和6.28％,低于B47菌液和百菌清的防治效果。在小区防治试验中,接种病原菌1天前和接种病原菌1天后分别施用浓度为300mg·L-1的iturinA2,其防治效果分别为88.60％和78.97％,表明iturinA2的保护作用大于治疗作用。在施用时间相同的情况下,iturinA2的防治效果显著高于B47菌液和百菌清的防治效果。大田试验结果表明,施用浓度为300mg·L-1的iturinA2,防治效果为53.05％,显著高于B47菌液的防治效果,但与百菌清的防治效果相当;当iturinA2使用浓度提高到500mg·L-1时,其防治效果提高到64.15％,显著高于百菌清的防治效果。试验结果表明iturinA2对玉米小斑病具有较好的生防潜力。
5.在玉米叶面喷施iturinA2后的0、3、6和9d,利用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测iturinA2是否能从叶片表面渗透到叶组织内,试验结果表明,iturinA2不具有内渗作用,只能残留在叶表面起保护作用。在玉米叶面喷施iturinA2后,每隔2d用RP-HPLC法检测了iturinA2在玉米叶片上的残留量,发现iturinA2的残留量在田间和温室条件下均随时间的推移而下降,在田间的下降速度较快。该物质在田间和温室中的残留期分别为27d和36d。通过离体接种病原菌和活体接种病原菌的方法检测到iturinA2在田间和温室中的持效期分别为9d和18d。通过测定iturinA2不同残留量对玉米小斑病抑制作用的影响,发现iturinA2对玉米小斑病的抑制能力随其残留量的下降而下降。当iturinA2的残留量等于或大于161μg·g-1时,能完全抑制玉米小斑病的发生;当其残留量在113-151μg·g-1之间时,能部分抑制玉米小斑病的发生;当其残留量等于或低于72μg·g-1时,对玉米小斑病没有抑制作用。