背景与目的胃癌是全球最常见的癌症之一，仅次于肺癌、乳腺癌和肠癌，居第四位，而且超过70%的病例出现在发展中国家，其中50%以上的病例出现在东亚地区。此外，胃癌也是世界上因癌症导致男女两性死亡的第二大原因之一。在亚洲，胃癌是位于乳腺癌和肺癌之后的第三大最常见癌症，居癌症死因的第二位，仅次于肺癌。尽管近年来胃癌的发病率与死亡率在许多国家呈下降的趋势，但它仍然是各地区突出的公共卫生问题之一。因此，在不久的将来，胃癌仍为人类疾病最大的经济负担之一。尽管目前胃癌的治疗手段都比较先进，各种辅助化疗的发展在一定程度上提高了临床的治疗效果，然而，伴有淋巴结转移的晚期胃癌预后仍然很差。因此，有学者认为，一些基因可能有助于胃癌向恶性潜能转化，但具体要鉴别哪些基因可以预测胃癌的预后和复发仍然需要更深入的研究。microRNAs(微小RNA，miRNAs)是一种成熟的内源性、非编码的单链小分子、高度保守的RNAs，于转录后水平发挥作用，通过干扰靶mRNA切割或抑制翻译来调控基因的表达。已经有研究证实，miRNA长度为21～25个核苷酸，在多种人类疾病中发挥作用并参与几乎所有的生物学进程，包括疾病的发展、细胞分化、增殖与死亡。研究发现，miRNA的异常表达与实体癌（其中包括胃癌）的发生、发展和预后都有密切联系，这提示miRNA可以作为肿瘤抑制基因或癌基因而存在。而且，胃癌的发生、发展是一个集遗传、环境及生活习惯等多因素、多机制、多步骤的演进过程，其中，基因多态性是决定胃癌个体易感性和临床转归的一个重要因素。目前，有学者认为出现在miRNA或其结合部位的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是导致miRNA遗传变异的的异常源头，从而导致癌症易感性的差别。基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基，其中最少一种在群体中的频率不小于1%，这种基因组的单个位点上的碱基的差异称为SNPs，它是存在于人群体中每个个体的基因序列细微差别，在整个人类基因组中分布相当广泛，其具有的生物学功能，可以通过影响成熟miRNA的二级结构、表达水平及其与靶基因的识别，使miRNA的调控网络发生异常，进而与肿瘤的发生发展密切相关。虽然大多数SNPs并不影响基因的功能，但一些特定区域的SNPs可以使人容易罹患疾病或影响对药物的敏感性。miRNA基因序列中的SNPs与癌症易感性关系的研究，开启了探索癌症发展分子生物学机制的新途径。研究表明，在许多不同类型的癌症中，如肝癌、前列腺癌、乳头状甲状腺癌和乳腺癌中均发现miR-146a异常表达，这可能在癌症的发生发展中充当一种新的调节器的作用。有报道认为，miR-146a中一种G/C多态现象rs2910164是影响乳头状甲状腺癌中miR-146a表达的原因，这同样也与肝细胞癌、前列腺癌、乳头状甲状腺癌和乳腺癌患病风险有关系。然而，由于胃癌中miR-146a的表达同时具有上调和下调作用，故此miR-146a与胃癌之间的关系仍然具有争议性。因此，本实验致力于验证胃癌组织和细胞系中miR-146a的表达，找出多态现象rs2910164与胃癌患病风险之间的特征性关系，从而有助于确定miR-146a在胃癌中的确切作用。本实验发现，在人胃癌组织中的miR-146a呈下调表达，这与胃癌细胞中得出的结果一致。携带miR-146a变异GC/CC基因型的个体与携带野生型GG基因型的个体相比，前者患胃癌的风险要低于后者；此外，从G碱基到C碱基的突变，可以导致胃癌病人中成熟miR-146a表达的上升。上述结果均表明miR-146a在胃癌病人中发挥肿瘤抑制基因的作用，由此提供证据证明了miR-146a的SNPrs2910164可能在胃癌的预后中发挥重要的作用。方法1.收集胃癌标本本病例组选取2009年7月至2013年3月在江西省南昌大学第一附属医院及广州医学院附属肿瘤医院接受手术治疗，并经临床资料和病理组织学检查确诊的胃癌患者417例，并对每病例收集配对的癌组织和非癌组织。男264例，女153例，平均年龄（51.53±12.57）岁。其中H.pylori阳性患者有119例（占28.54%），H.pylori阴性患者有298例（占71.46%）；138例患者有吸烟史（占33.09%）；76例患者有胃癌家族史（占18.23%）。2.收集非癌症对照样本同期从南昌疾控中心获得了相同地区的420例健康对照者，并同时收集其血液样本。男250例，女170例，平均年龄（44.87±7.49）岁。其中H.pylori阳性患者有104例（占24.76%），H.pylori阴性患者有316例（占75.24%）；119例患者有吸烟史（占28.33%）；58例患者有胃癌家族史（占13.81%）。3.细胞培养实验对人的胃上皮细胞系(GES-1)和6种胃癌细胞系(AGS,BGC-823, HGC-27, MKN-28, MKN-45and SGC-7901)进行培养。4. RNA的提取与miR-146a的检测实验用TRIzol分别提取组织与细胞中的总RNA，并获得相应的cDNA，运用qRT-PCR测出样本中miR-146a与miR-146a前体的含量。5. miR146a的瞬时转染实验选miR-146a表达水平最低的AGS细胞作转染实验，用miR-146a mimic和NC对AGS细胞进行12孔板的转染，测定转染效率。6.细胞增殖实验转染24小时后的AGS细胞按每孔0.5×104个细胞的密度接种于96孔板中，孵育24小时后，用CCK-8试剂按试剂盒检测其增殖能力。7.克隆形成实验转染24小时后的AGS细胞按每孔1000个细胞的密度接种于新的6cm培养皿中孵育10天，进行克隆形成分析。8.细胞周期分析收集转染24小时后的AGS细胞经过相应的处理，通过流式细胞仪对细胞的DNA含量进行分析。9.血液样本的DNA分离及基因分型应用QuickGene DNA全血试剂盒（富士，东京，日本）来提取全血样本中的基因组DNA，并用7500实时PCR系统(AppliedBiosystems)对miR-146a SNP (rs2910164, G/C)进行基因分型工作。10.统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析。病例组与对照组之间基本情况的比较采用χ2检验；采用χ2检验计算Hardy-Weinberg平衡吻合度，分析对照组人口学特征和各位点基因型频率的观察值与预期值，评估其代表性；以多因素Logistic回归法计算表示胃癌发病相对风险度的比值比（odds ratio, OR）及其95%可信区间（confidence interval, CI）。P <0.05为差异有统计学意义。结果1.病例组与对照组的一般资料无统计学差异病例组（417例）与对照组（420例）在性别(P=0.261)、年龄（P=0.292）、H. pylori的感染状态(P=0.217)、居住地（P=0.103）、胃癌家族史(P=0.082)、吸烟史(P=0.135)等方面无统计学差异（P值均大于0.05）。2.胃癌标本中miR-146a呈低表达随机抽取的53例胃癌标本中，相对于配对正常组织，50例（94.3%）胃癌组织中miR-146a的表达降低，组间差异有统计学意义（P <0.01）。3.胃癌细胞系中miR-146a呈低表达与人的正常胃上皮细胞系（GES-1）相比，六种来源于胃癌的细胞系（AGS, BGC-823, HGC-27, MKN-28, MKN-45和SGC-7901）中的miR-146a均呈现明显的低表达（P值均小于0.05）。4. miR146a的瞬时转染实验选miR-146a表达水平最低的AGS细胞作转染实验，发现转染了miR-146a mimic的细胞与单纯转染NC或未转染（Mock组）的AGS细胞比较，miR-146a的表达水平呈明显的上调（P <0.01）。5. miR146a对细胞增殖能力的改变转染24小时后的AGS细胞，通过CCK-8法发现转染miR-146a mimic的细胞增殖率明显低于NC对照组细胞（P <0.01）。克隆形成实验中，miR-146a mimic转染组AGS细胞的克隆形成率低于对照组（P<0.05）。6.细胞周期通过流式细胞仪分析转染24小时后的AGS细胞，显示转染miR-146a mimic的细胞更多集中在G0/G1期（P <0.05）。7.不同rs2910164基因型与胃癌患病风险的关系携带rs2910164GC和CC基因型的个体患胃癌的风险比GG纯合子携带者低约0.605倍(95%CI,0.368-0.912;P=0.011)；此外，C等位基因与G等位基因比较，前者与胃癌的发生呈显著的低相关性(OR=0.611;95%CI,0.504-0.922; P=0.008)。8.不同rs2910164基因型与胃癌易感性的关系分层分析后发现，rs2910164的GC/CC基因型携带者患淋巴结转移的风险明显低于GG纯合子携带者（OR=0.527;95%CI:0.360-0.791; P=0.005）；此外，Ⅲ/Ⅳ期的胃癌病人中，GC/CC基因型携带者的患癌风险低于GG纯合子携带者(OR=0.622;95%CI:0.423-0.917; P=0.023)。9.多态位点rs2910164的G/C基因变异对miR-146a表达的影响mir-146a SNPrs2910164的不同基因型胃癌病人中，GG、GC和CC基因型的分布分别是30(46.15%)、26(40.00%)和9例(13.85%)。与rs2910164GG基因型相比，GC、CC和GC/CC基因型携带者均表现出较高的成熟mir-146a表达水平（P均小于0.01）；但是，上述三种基因型携带者与GG基因型的病人相比，组间pri-miR-146a的表达水平没有统计学差异（图4B，均P>0.05）。结论1． miR-146a通过抑制胃癌细胞的增殖和克隆形成能力，在胃癌中发挥肿瘤抑制基因的作用。2. miR-146a多态位点rs2910164C等位基因携带者的胃癌易感性相对低于G纯合子携带者。3．miR-146a多态位点rs2910164C等位基因的携带者中成熟miR-146a的表达高于G纯合子携带者。