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EB病毒与多种肿瘤的发生发展密切相关，如伯基特淋巴瘤、霍杰金氏淋巴瘤，鼻咽癌、乳腺癌和胃癌等上皮性肿瘤。作为一个外界环境致病因子，对其基因组功能分析发现其编码的潜伏膜蛋白1（latent membrane protein 1，LMP1）是一个重要的瘤蛋白。在LMP1的羧基末端存在三个功能性结构域CTAR1、CTAR2和CTAR3，它们通过募集信号衔接分子TRAFs、TRADD和JAK3异常激活NFκB、AP-1和STAT三条信号转导通路。激活的转录因子NFκB、AP-1和STAT进而调节下游靶基因EGFR、cyclin D1、MMP9、survivin等的表达和磷酸化。在对EB病毒致瘤蛋白LMP1激活宿主单条信号通路研究的基础上，新近我们研究小组采用新的研究策略——信号转导蛋白质组学，简称为信号组学（signalomics），初步构建了EB病毒瘤蛋白LMP1介导的信号转导通路虚拟网络。在上皮来源的鼻咽癌细胞中，通过分析磷酸化蛋白的蛋白组学，即比较不同细胞的二维凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis，2DE）蛋白谱，获得差异蛋白点，再用质谱（MALDT-TOF-MS）技术和ESI多肽序列进行鉴定，发现了25个受LMP1调节的新的磷酸化蛋白。并以鉴定的蛋白质分子Annexin A2为代表，建立LMP1与下游功能效应蛋白质分子的关系。前期实验证明了“LMP1→PKC→p-ser-Annexin A2”这条新的信号通路；而且发现EBV致瘤蛋白LMP1介导蛋白激酶PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化，使Annexin A2移位入核，并确定LMP1调节Annexin A2的入核是能量和温度依赖性的。PKC是细胞内一类非常重要的钙、磷脂依赖性蛋白丝氨酸／苏氨酸激酶，PKC各同工酶的分布具有特殊性，并在细胞功能方面各自发挥着不同的作用。Annexin A2是Annexins这类钙离子依赖性的蛋白家族中的一员，Annexin A2与细胞的转化和肿瘤的发生发展密切相关，在多种肿瘤细胞中均存在Annexin A2蛋白表达和磷酸化水平的上调。在细胞内，Annexin A2以36kD的单聚体形式和与p11结合形成AnxⅡ2／p112 94kD的四聚体形式存在。PKC是除NFκB、JNK、JAK／STATs、MAPK和PI3K／Akt外，我们首次发现的可由LMP1介导的另外一个蛋白激酶。Annexin A2是PKC的下游效应分子，其磷酸化是细胞恶性转化的重要分子机制之一。在上皮来源的鼻咽癌细胞中，对LMP1介导PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化分子机制及其生物学功能的研究，有助于进一步完善这条新的信号通路。为此我们确定了“EB病毒LMP1介导PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化的分子机制研究”这一课题，采用LMP1阴性的CNE1和LMP1稳定表达的CNE1-LMP1鼻咽癌细胞系为主要实验材料。我们通过PKC Kinase Activity Assay Kit（Non-Radioactive，Stressgen）特异检测经过不同处理细胞的PKC激酶活性；同时使用抗丝氨酸抗体进行IP-Western blotting，检测细胞内Annexin A2丝氨酸磷酸化水平的变化。使用PKC激活剂TPA、阻断LMP1表达的脱氧核酶Dz1和PKC特异性活性抑制剂发现，PKC的活化状态与Annexin A2丝氨酸磷酸化状态的变化趋势一致，因此得出结论：LMP1确实可通过PKC调控Annexin A2丝氨酸磷酸化，进一步确定了这条通路的存在。PKC属于“IP3、DAG信号系统”，磷脂酰肌醇磷脂酶C（phosphoinositide-specific phospholipase C，PI-PLC）是PKC的上游关键性激酶，PLC同功酶中以PLC-β和PLC-γ的功能最为重要。使用特异针对PLC-β和PLC-γ的激酶活性抑制剂U73122，并以结构相似但无活性的小分子U73343和载体DMSO作为对照，研究PI-PLC激酶对PKC激酶和PKC下游效应蛋白Annexin A2丝氨酸磷酸化水平的影响。PI-PLC活性小分子抑制剂U73122能降低两种细胞系的PKC激酶活性，进而降低PKC下游蛋白Annexin A2的丝氨酸磷酸化水平。证实了LMP1介导PI-PLC调控PKC激酶活性和Annexin A2丝氨酸磷酸化水平。前期实验通过使用特异针对PKCα和PKCβ的抑制剂，证实了LMP1可能主要通过PKCα和PKCβ调控Annexin A2丝氨酸磷酸化。我们进一步研究PKC亚型对Annexin A2丝氨酸磷酸化的调控机制。通过免疫共沉淀结合Western-Blotting，发现在细胞内PKCα和PKCβ均可直接与Annexin A2结合；而且LMP1对PKCα、PKCβ的激酶活性都有上调的作用，但以对PKCβ的调控更显着。继而我们在CNE1和CNE1-LMP1细胞中转染PKCα、PKCβ特异性shRNA质粒，特异且有效地阻断PKCα、PKCβ的蛋白表达，发现在两种细胞系中PKCαshRNA和PKCβshRNA质粒均能有效降低p-ser-Annexin A2水平，证实在CNE1和CNE1-LMP1细胞内PKCα和PKCβ两种亚型均调控Annexin A2的丝氨酸磷酸化。进一步我们进行了重组活性激酶PKC和纯化的GST-annexin A2之间的体外蛋白激酶反应。结果表明，活性PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ均可丝氨酸磷酸化Annexin A2，从而在细胞外水平提供了PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ使Annexin A2丝氨酸磷酸化的新证据。我们前期研究发现LMP1调节Annexin A2丝氨酸磷酸化而移位入核。在Annexin A2的氨基末端包含有体内外证实的PKC调节的丝氨酸磷酸化位点Ser25和体外证实的丝氨酸磷酸化位点Ser11。确定了在CNE1和CNE1-LMP1细胞中，PKCα、PKCβ均可调控Annexin A2的丝氨酸磷酸化后，我们构建了pEGFP-AnxⅡ野生型表达质粒和三个突变质粒（分别将Ser11、Ser25、Ser11和Ser25均突变成谷氨酸），以进一步确定Annexin A2的具体丝氨酸位点的磷酸化对其入核的影响。通过免疫荧光和激光共聚焦显微镜发现Annexin A2丝氨酸25位的磷酸化影响其入核。进一步通过胞浆胞核分开抽提Western-Blotting，定量检测野生型和三种突变质粒表达蛋白的细胞分布予以了证实。前期实验已经表明PKCαshRNA、PKCβshRNA质粒特异降低PKCα、PKCβ的蛋白表达水平，并进一步降低p-ser-Annexin A2水平，而且只有pEGFP-AnxⅡWT和S11E质粒的表达蛋白可以入核。以CNE1-LMP1细胞为代表，将WT和S11E质粒分别与PKCαshRNA和／或PKCβshRNA质粒共转染CNE1-LMP1细胞，依次与WT和S11E质粒转染CNE1-LMP1细胞的胞浆、胞核蛋白中EGFP-Annexin A2融合蛋白的分布情况比较。结果表明，PKCαshRNA、PKCβshRNA质粒均能降低野生型和S11E突变质粒表达蛋白的入核程度，进一步证实了p-ser-Annexin A2水平影响Annexin A2的入核，同时提示我们PKCα、PKCβ确实可以通过调控Annexin A2丝氨酸25位磷酸化影响其入核。Annexin A2磷酸化而入核，入核后可提高DNA聚合酶α的活性，从而促进DNA复制和细胞增殖。我们使用CellTiter-Glo? Luminescent Cell Viability Assay（Promega），检测Annexin A2丝氨酸25位磷酸化入核后对细胞增殖的影响。结果表明两种细胞中转染了pEGFP-AnXⅡWT和S11E质粒的细胞增殖速率明显快于转染了S25E和S11ES25E质粒的细胞。提示我们由于Annexin A2丝氨酸25位突变后不能被PKC正常磷酸化，影响Annexin A2入核发挥促进细胞增殖的功能，从而进一步确定了Annexin A2丝氨酸25位磷酸化对其生物学功能的重要性。Annexin A2丝氨酸25位磷酸化与其入核密切相关，而丝氨酸11位没有明显影响。有研究发现，四聚体形式的Annexin A2在细胞膜上被PKC磷酸化后，有利于四聚体从细胞膜上解离下来和其自身解离，而且这种解离主要由Annexin A2的丝氨酸11位磷酸化所决定，可能是因为Ser11位于配体蛋白p11结合序列（Annexin A2的氨基端1-13位）内。LMP1是否介导PKCα和PKCβ使Annexin A2丝氨酸11位磷酸化，从而调节Annexin A2四聚体形式的解离和从细胞膜上的释放，有待我们进一步的研究。综上所述，通过本研究我们发现在鼻咽癌细胞中，EB病毒LMP1可通过PI-PLC上调PKC激酶活性和Annexin A2丝氨酸磷酸化水平，即进一步确定了“LMP1→PI-PLC→PKC→p-ser-Annexin A2”这条新的信号通路的存在。细胞内实验证明了LMP1介导PI-PLC-PKCα／PKCβ信号通路增加Annexin A2丝氨酸磷酸化水平，并且主要通过激活PKCβ；同时活性激酶PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ可以体外丝氨酸磷酸化Annexin A2，从细胞外水平证明了Annexin A2是PKCα、PKCβⅠ和PKCβⅡ的直接蛋白底物。Annexin A2在细胞核内促进DNA复制和细胞增殖；通过将Annexin A2氨基端丝氨酸11位和丝氨酸25位突变成谷氨酸，使这两个位点不能被PKC正常磷酸化，进一步证明Annexin A2丝氨酸25位的磷酸化影响其入核和促进细胞增殖的生物学功能。我们确定了“LMP1→PI-PLC→PKCα／PKCβ→p-ser25-Annexin A2→Annexin A2入核→促进细胞增殖”这条新的信号通路，发现了两个受LMP1调控的新的蛋白激酶PI-PLC和PKC；深入阐明了Annexin A2的磷酸化和入核机制，证明了LMP1介导PI-PLC-PKCα／PKCβ使Annexin A2丝氨酸25位磷酸化及入核，进而影响Annexin A2在细胞核内发挥促进细胞增殖的生物学功能，证明了Annexin A2是LMP1新的下游靶分子。从而为LMP1促进细胞增殖的功能提供了新的实验证据，为完善EB病毒致瘤蛋白LMP1的致瘤网络提供了新的实验证据。