肺癌是严重威胁全人类健康与生命的恶性肿瘤,其发病率和死亡率居恶性肿瘤之首。近年来我国肺癌发病率迅速上升,每年新增肺癌80余万,超过60万人死于肺癌。导致肺癌高死亡率的主要原因是转移、复发和耐药。目前尚无有效治疗肺癌的转移、复发和耐药的药物和方案。近年来的研究证明肿瘤干细胞在多种恶性肿瘤的转移、复发、耐药中发挥重要作用。靶向肿瘤干细胞的治疗新策略将有可能显著提高治疗肿瘤的疗效、减低死亡率。抗体靶向药物治疗肿瘤在临床上已广泛应用,取得了令人鼓舞的疗效和安全性。实现抗体靶向肺癌干细胞治疗新策略的前提和关键必须首先获得肺癌干细胞特异表达的功能性膜蛋白靶分子。为此,本文在前期研究中,从肺癌大容量功能性单抗库中获得了39株抗肺癌膜蛋白的单抗,在此基础上进一步筛选鉴定抗肺癌干细胞的功能性单抗及其与肺癌干性相关的膜蛋白分子。本室在前期研究中,用多例人肺癌组织分离的肿瘤细胞免疫小鼠,采用杂交瘤技术建立了大于4000个克隆以上的肺癌大容量功能性单抗库,从中筛选获得了39株与肺癌活细胞呈阳性反应的抗肺癌膜蛋白的单抗。本文从这39株单抗中选择了8株对其靶抗原蛋白进行了一系列生物学特性的研究。首先采用固定细胞和活细胞免疫荧光法检测了8株单抗识别的抗原蛋白在3种肺癌细胞系(肺腺癌A549、GLC-82和肺鳞癌GLC-P)中的亚细胞定位。结果显示,8株单抗识别的抗原蛋白在胞浆均有表达,其中7株单抗的靶抗原在3株细胞膜上均有表达,证明这7株单抗的靶抗原是肺癌膜蛋白。流式细胞术检测了8株单抗的靶抗原在这3株肺癌细胞膜上均有不同比例的阳性表达,其中4株表达比例较高(4.3%-36.3%)。采用免疫组织化学法检测了8株单抗分别在61-111例肺癌组织及癌旁组织中的表达,结果表明其中7株单抗的靶抗原在人肺癌组织中的阳性表达比例为80.8%-95%,而相应的癌旁正常组织中的阳性比例仅为8.1%-19.6%,具有较高的肺癌组织特异性和敏感性,这是可作为抗体靶向治疗靶分子极重要和关键性的特征。为了筛选在体内能抑制肺癌生长的功能性单抗,以便确定这些功能性单抗识别的抗原蛋白在肺癌生长转移中的作用,我们建立了肺癌细胞和产生单抗的杂交瘤细胞同时接种裸鼠的共接种模型,在此模型中试验了8株单抗对裸鼠肺癌移植瘤生长的影响,结果表明其中4株均能不同程度的抑制肺癌裸鼠移植瘤的生长,其抑制率达37.0%-71.2%,表明这5株单抗的靶抗原蛋白在促进肺癌体内生长中发挥重要作用。选择对肺癌生长抑制度较高的2株单抗,采用CCK-8法和Transwell法在肺腺癌细胞系GLC-82和肺鳞癌细胞系GLC-P中检测分析了它们对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭功能的影响,结果发现,5E6单抗能明显抑制肺腺癌和肺鳞癌细胞的侵袭和迁移功能,抑制率达31.4%-38.5%和27.5%-58.3.%,而对增殖无明显作用。12H6单抗能明显抑制肺癌细胞的增殖和侵袭功能,抑制率分别达15.9-11.4%和20.2-46%,表明这2株单抗的靶抗原在肺癌细胞的侵袭迁移和增殖侵袭中有重要的作用。综上所述,以上的研究结果表明2株单抗识别的靶抗原是表达于肺癌细胞表面的膜蛋白；在人肺癌细胞系和人肺癌组织中特异的高表达；在促进肺癌细胞增殖、侵袭和迁移以及体内肿瘤生长中发挥重要作用,具有作为抗体靶向治疗肺癌的功能性分子靶标的应用潜力。由于肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC)在肿瘤转移、复发、耐药及高死亡率中发挥重要作用,因此本研究对8株膜蛋白单抗的靶抗原的肿瘤干细胞特征进行了检测分析。首先根据肿瘤干细胞具有在无血清悬浮培养中呈球形生长的自我更新特点,对化疗药抵抗耐药,能被PKH26染料特异性标示以及表达多种干细胞的标志物等特点,我们对肺癌细胞系A549中的CSC进行了鉴定。比较A549亲本细胞和sphere细胞对化疗药物顺铂的耐药性发现,sphere细胞的IC50为11.17μg/ml,显著高于亲本细胞的4.091μg/ml,P<0.05,其耐药性显著高于亲本细胞。球体细胞中有单个被PKH26染色的CSC存在。流式细胞免疫荧光检测显示,干细胞的相关标志物CD117、CD133在sphere培养的球体细胞中的阳性比例比亲本细胞分别提高了5.4倍和3.3倍。这些研究证明A549肺癌细胞系中存在有肺癌CSC,可以从中分离肺癌CSC进行肺癌单抗靶抗原肿瘤干细胞特性的研究。用流式细胞术检测8株单抗的靶抗原在sphere细胞中的表达,结果发现,其中5E6单抗的靶抗原在sphere细胞中的表达较亲本细胞高1.2倍,具有肿瘤干细胞特性。采用单抗与特异标示干细胞的PKH26染料共染检测结果显示,5E6靶抗原最强的荧光可以和PKH26共染于同一个细胞,表明该5E6靶抗原在肺癌CSC中有更强的表达。应用双色免疫荧光检测分析结果表明,5E6单抗的靶抗原在78.7%的CD117+和91.6%的CD133+的肺癌CSC中表达。采用流式细胞分选技术从A549细胞分选5E6单抗阳性、阴性和亲本细胞,比较他们对化疗药顺铂的耐药性,结果显示,它们的IC50值分别为17.24,1.67和4.51μg/ml,5E6单抗靶抗原表达的阳性细胞的耐药性较表达阴性细胞高8倍,以上这些研究结果表明,5E6单抗是抗肺癌干细胞的单抗,5E6单抗的靶抗原是表达于具有自我更新能力、耐药、表达干细胞标志物的肺癌干细胞表面的膜蛋白分子。应用sphere培养和Transwell法检测5E6单抗的功能发现,5E6单抗能明显抑制肺癌干细胞的增殖、侵袭和迁移功能,其抑制率分别为15.9%、28.4%和57.5%,是肺癌干细胞功能性单抗,其靶抗原可能是肺癌干细胞的功能性膜蛋白分子。为了分离获得5E6单抗识别的具有肺癌干细胞特征的功能性膜蛋白基因,我们首先采用Western Blot在肺癌细胞的蛋白中鉴定了单抗识别的靶抗原分子的分子量为95KD、60KD、45KD和36KD左右。纯化5E6单抗后采用亲和层析技术和SDS-PAGE胶电泳分离获得这4个条带的5E6抗原蛋白,采用MALDI-TOP-PMF蛋白质谱技术进行分析,结果5E6单抗的靶抗原为G蛋白基因,但尚未见到在肿瘤干细胞中表达及相关研究的报道。我们应用细胞免疫荧光法和Co-IP法回证了单抗5E6的靶抗原为G蛋白。以上这些研究首次分离鉴定获得了肺癌干细胞相关的功能性膜蛋白基因,并初步证明其具有作为功能性分子靶标的潜力。同时也为肺癌干细胞的靶向治疗提供了有应用价值的功能性候选单抗药物。