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背景和目的:Nell-1(Nel-like 1)是一种新型信号分子,它在成骨细胞分化、骨形成及骨再生过程中起到重要的正调控作用。本课题组前期研究发现,Nell-1可以促进成牙本质细胞分化、牙本质形成,促进牙髓干细胞神经向分化。有研究显示,脐静脉内皮细胞及牙髓干细胞共培养可以促进血管向分化。本课题旨在通过体内及体外研究,检测Nell-1是否在牙髓干细胞血管向分化过程中起调节作用。材料方法:1.人牙髓干细胞的分离、培养及鉴定从无龋坏、无根尖周病的智齿中分离获得牙髓干细胞。利用流式细胞术来检测牙髓干细胞表面的间充质干细胞标记物及造血干细胞标记物的表达。通过成骨及成脂实验来检测其多向分化能力。2.将牙髓干细胞单独培养或与脐静脉内皮细胞共培养时,Nell-1对其血管向分化的体外研究首先利用细胞免疫荧光技术检测Nell-1在牙髓干细胞及脐静脉内皮细胞中的表达及分布情况。利用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR,quantitative real-time polymerase chain reaction)、酶联免疫吸附反应(ELISA,enzyme-linked immunosorbent assay)、Matrigel 基质胶血管形成及 Western Blot 技术,检测血管生成相关标记物的表达水平,探讨Nell-1对牙髓干细胞血管向分化的影响。3.Nell-1促进牙髓干细胞血管向分化的体内研究首先利用免疫荧光双染技术,检测Nell-1与血管生成相关标记物VEGF、Flk-1在大鼠正常牙髓组织的表达情况。建立大鼠牙髓炎模型,分别将浸有及不浸有Nell-1蛋白的胶原海绵覆盖在大鼠磨牙穿髓孔处,选择正常大鼠磨牙组织作为阳性对照,利用HE染色、免疫组化观察不同组之间血管数量的差别。结果:1.成功分离、培养出牙髓干细胞利用组织块酶消化法获得的牙髓细胞呈长梭形,贴壁生长。单克隆获得牙髓干细胞。矿化诱导及成脂诱导21天后,茜素红及油红O染色显示分别有矿化结节形成、脂滴形成,证明该细胞具有成骨/牙本质向及成脂向分化潜能。流式细胞仪分析结果显示,牙髓干细胞高表达CD90(98.3%)、CD44(99%)、CD105(99.4%),低表达 CD34(4.53%)、CD45(14%)。2.在牙髓干细胞单独培养及与脐静脉内皮细胞共培养的体外实验中,Nell-1均能够促进其血管生成相关基因及蛋白的表达将牙髓干细胞及脐静脉内皮细胞分别与含0、50、100、200 ng/ml Nell-1的完全培养基共培养1天、3天、5天、7天,CCK-8检测显示,Nell-1对牙髓干细胞及脐静脉内皮细胞的增殖没有影响。细胞免疫荧光结果显示,Nell-1在牙髓干细胞及脐静脉内皮细胞的细胞核中高表达。在牙髓干细胞单独培养,及与脐静脉内皮细胞共培养的体外实验中,Nell-1均能促进VEGF、Flk-1的表达。牙髓干细胞与脐静脉内皮细胞在Matrigel胶上共培养时,Nell-1能够促进类血管样结构的形成。3.Nell-1能够促进炎症牙髓组织中的血管形成大鼠正常牙髓组织免疫荧光双染显示,Nell-1与血管生成相关标记物VEGF、Flk-1在牙髓组织中共表达。HE染色显示,在大鼠牙髓炎模型中,相比于胶原组,Nell-1组近穿髓孔处的区域炎症浸润较少。CD31及CD34免疫组化染色显示,Nell-1组在近穿髓孔处的区域血管形成较多。结论:体外及体内结果表明Nell-1能够促进牙髓干细胞血管向分化,本实验对于全面认识Nell-1在牙髓再生中的作用提供了理论基础及实验室依据。