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二噁英类化合物(Dioxin-like compounds,DLCs)是高度脂溶性的环境污染物,由土壤、水或饲料转入食物链,具有致死作用与废物综合征、氯痤疮、肝毒性、发育毒性、生殖毒性、致畸性、致癌性、免疫毒性和内分泌紊乱等多种毒性作用。鱼类CYP1A的诱导可被作为机体暴露于二噁英类化合物(Dioxin-like compounds,DLCs)的早期预警信号及高度敏感的生物反应,而7-乙氧基-异吩噁唑酮-脱乙基酶(7-ethoxyresoufin-O-deethylase,EROD)是细胞色素P4501A1(Cytochrome P4501A1,CYP1A1)介导的单加氧酶系统的典型酶。斑马鱼(Brachydanio rerio/Daniorerio)是世界标准化组织认可的模式实验动物之一,它不像哺乳动物,其CYP1A未分化为cypla1和cypla2两种亚型,而只有一个cypla基因。本研究以DLCs中的典型代表2,3,7,8-四氯二苯并二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin,TCDD)及3-甲基胆蒽(3-Methylcholanthrene,3-MC)分别对斑马鱼进行水浴染毒,观察3-MC对斑马鱼组织病理学的变化并找出作用的靶器官,并利用生物学方法探讨这两种DLCs分别暴露对斑马鱼EROD酶活性及cypla mRNA的诱导作用,以期在分子水平筛选出合适的生物标志物,为检测饲料、水体、食品中DLCs的污染奠定基础。研究获得以下结果:
1.病理组织学检查发现,经3-MC水浴暴露后,斑马鱼肝细胞变性,坏死、溶解,造成机体内物质代谢障碍;斑马鱼鳃小片表面粗糙,上皮细胞不完整,引发呼吸障碍:斑马鱼心肌细胞萎缩坏死;斑马鱼肠道上皮细胞坏死,微绒毛减少以及肾小管上皮细胞肿胀,细胞界限不清,管腔内均质红染。
2.经TCDD、3-MC分别暴露,均引起斑马鱼肝、鳃EROD酶活性显著增加。暴露48h后,与对照组相比,TCDD各暴露组斑马鱼肝、鳃EROD酶活性均极显著增加(P<0.01)。就3-MC各暴露组中斑马鱼肝EROD酶活性而言,25μg/L暴露组显著增加(P<0.05),其余各组极显著增加(P<0.01);而各暴露组斑马鱼的鳃EROD酶活性均极显著增加(P<0.01)。EROD酶活性分别与TCDD、3-MC形成良好的浓度(剂量)-效应关系。
3.从供试的斑马鱼肝脏中克隆获得了cypla基因cDNA片段序列,经序列分析比对,该序列含有cylpla的cDNA及其特征序列,和已发表的斑马鱼cypla的cDNA同源性为99%,表明该基因片段是斑马鱼的cypla基因。
4.利用RT-PCR方法研究了TCDD、3-MC分别暴露,对斑马鱼cypla mRNA表达的影响。在TCDD暴露48h后,各暴露组斑马鱼的肝cypla mRNA表达量增加,与对照组相比,0.05μg/L暴露组差异不显著(P>O.05),其余各组差异极显著(P<0.01);鳃cypla mRNA表达量也增加,其中0.05μg/L的暴露组差异显著(P<0.05),其余各组差异极显著(P<0.01)。在3-MC暴露48h后,各暴露组的斑马鱼肝cyplamRNA表达量增加,与对照组相比,均差异极显著(P<0.01):鳃cypla mRNA表达量也增加,25μg/L暴露组差异显著(P<0.05),其余三组差异极显著(P<0.01)。cypla mRNA与TCDD、3-MC浓度之间存在明显的剂量-效应关系。