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研究背景:乙型病毒性肝炎是常见的感染性疾病之一,在世界各地均有不同程度的流行,目前世界约有3.5亿人为慢性乙型肝炎(CHB)。慢性乙型肝炎是一种潜在的进展性致死性疾病,据世界卫生组织资料显示,乙肝已成为人类第九大死因。我国是乙型病毒性肝炎的流行大国,其中HBV携带者约占人口的10%,即1.2亿人,约占世界乙肝病毒携带者的1/3,而携带者中又有约15%～40%的感染者发展为不同类型的肝病,如活动性肝炎、肝硬化、甚至原发性肝癌,而我国乙肝的发病率还呈持续上升趋势。机体感染HBV后的临床结局,多数人认为是由病毒、肝细胞和宿主免疫系统相互作用决定的。HBV基因突变是影响病毒生物学特性的基本因素之一,HBV基因突变有可能改变病毒的复制能力和致病性、改变抗原表位而影响免疫应答,进而可能造成严重的肝细胞损伤等。研究表明前C/BCP(基本核心启动子)区突变可影响HBeAg的表达/分泌,认为分泌型HBeAg与HBcAg有共同的抗原表位,可以减缓细胞毒T淋巴细胞( CTL)对表达HBcAg的肝细胞的攻击,故而该区突变不利于免疫耐受,与慢性肝炎的病情加重有关。但对上述观点也存在争议。人白细胞抗原Ⅰ类分子(Human leucocyte antigenⅠ,HLA-Ⅰ)是由人类主要组织相容性复合体编码的一类糖蛋白,广泛存在于有核细胞表面。HLA-Ⅰ抗原在免疫系统中起关键作用,是参与机体特异性免疫反应的主要分子。正常人肝实质细胞HLA-Ⅰ表达甚微或基本不表达,当HBV感染后,肝细胞上HLA-Ⅰ表达异常。血清可溶性HLA-Ⅰ分子(soluble HLA-Ⅰ,sHLA-Ⅰ)与组织HLA-Ⅰ分子有共同的多态特异性决定簇。sHLA-Ⅰ在正常人血清中的含量很低且相对恒定,HBV感染后,血清sHLA-Ⅰ水平明显升高。本文就HBV前C/BCP区突变和机体sHLA-Ⅰ水平解析他们与慢性HBV感染病情发展的关系;并研究他们二者的相关性。研究对象:本实验以在汾阳医院就诊的吕梁地区慢性HBV感染患者为研究对象。目的:(1)比较三种HBV DNA提取方法对PCR产物量的影响。(2)探讨HBV前C/BCP基因突变和血清sHLA-Ⅰ与慢性HBV感染的发生、发展及转归的关系,并从机体免疫角度研究HBV基因突变对sHLA-Ⅰ水平的影响。方法:(1)采集山西医科大学附属汾阳医院就诊的HBsAg阳性的血清133例和健康体检者的血清20例,均于清晨空腹静脉采集,收集临床资料。(2)模板制备:分别用碱裂解法、直接煮沸法、裂解液煮沸法抽提患者血清中HBV DNA,比较所得DNA条带的阳性率、光密度值,寻找合适的模板提取方法。(3)采用巢式PCR法扩增,HBV前C/BCP区基因组不同区段分别设计两套引物,增加实验的灵敏度。(4)采用限制性片断长度多态性(RFLP)分析方法,对PCR产物进行酶切分析,确定HBV的突变型、野生型和混合型。为证实该方法的准确性,随机挑取一些PCR产物测序。(5)采用ELISA技术测定健康体检者和HBV感染者血清sHLA-Ⅰ水平。(6)统计学处理采用SPSS 13.0版统计软件。结果:(1)在3种不同的DNA抽提方法中,碱裂解法所得DNA条带亮度与条带面积均较好,阳性率高,模板量多,与其它组比有显著差异(P<0.01)。(2)本地区HBV感染人群BCP T1762A1764双突变率58.2%,PreCA1896突变率15.2%,两组间突变率比较有显著差异(P<0.001)。(3)HBeAg的表达与BCP双突变有显著相关性(P<0.01),与前C区A1896突变无明显相关性(P>0.05)。前C区A1896突变或BCP双突变从总体上与病情的发展有显著关系(P<0.05;P<0.01),但在慢性肝炎轻度、慢性肝炎中度和肝硬化组之间无显著差异(P>0.05)。(4)血清sHLA-Ⅰ水平在慢性肝炎患者的含量明显高于正常对照(P<0.01);并且随慢性肝炎病变加重有逐渐增加的趋势,但无统计学意义(P>0.05);无症状携带者组其含量也高于正常对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。(5)血清sHLA-Ⅰ表达与前C或BCP突变有关,突变组sHLA-Ⅰ表达明显增加,与正常组和未突变组相比有显著意义(P<0.05)。(6)将入选标本分为HBeAg(+)组和HBeAg(-)组,血清sHLA-Ⅰ水平在e抗原阴性患者中表达较低,但两组之间比较无显著差异(P>0.05)。结论:(1)碱裂解法在血清HBV DNA抽提中的效果最好。(2)慢性乙肝患者更容易发生BCP双突变,前C/BCP突变与乙肝病情发展有关。BCP区变异可作为携带者随访的重要指标, BCP区一旦有双突变发生,将预示病情会有发展。(3)前C/BCP区突变影响患者的免疫功能。肝脏细胞的损害会导致sHLA-Ⅰ的释放,sHLA-Ⅰ的水平与乙型肝炎的发展有关。