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1研究目的本研究的目的首先是观察呋喃二烯(FDE)在体外对18种广泛选取的、具有药效学统计基础的肿瘤细胞株生长的抑制作用,并在此基础上进行统计分析,观察该药物的抗瘤谱范围,评价该药物的体外药效,并进一步探讨其对筛选出的最敏感瘤株人胃癌细胞MGC-803诱导凋亡的作用研究;其次是呋喃二烯对人胃癌细胞MGC-803 nu/nu裸鼠移植瘤生长的影响,评价其体内药效,该成果将为FDE的药理药效深入研究提供基础。2研究方法2.1呋喃二烯抗肿瘤筛选为明确呋喃二烯在体外对各类肿瘤细胞株的增殖抑制作用,实验采用MTT法检测,观察不同浓度的FDE对各类肿瘤细胞株的增殖抑制作用。受试药物浓度设置指标为10、20、40、80、160、320、640μg/ml等共7个,受试药物的对象为以下肿瘤细胞株(人直肠癌细胞HT-29、人结直肠癌细胞DLD-1、人肺癌细胞NCI-H292、人高转移肺癌细胞95-D、人大细胞肺癌细胞NCI-H460、人非小细胞肺癌细胞NCI-H1650、人非小细胞肺癌细胞A-549、人肝癌细胞Hep G-2、人宫颈癌细胞He La、人结肠癌细胞HCT-116、人卵巢癌细胞SKOV-3、人恶性黑色素瘤细胞A-375、人胃癌细胞HGC-27、人胃癌细胞MGC-803、人原髓细胞白血病细胞HL-60、人慢性髓原白血病细胞K-562、人急性非B非T淋巴细胞白血病细胞Reh和人单核细胞白血病细胞THP-1),以5-氟尿嘧啶为阳性对照药,应用酶标仪检测其OD值,采用Graphpad Prism5.0的统计作图软件进行数据的整理分析、药物作用肿瘤细胞株生长趋势曲线的绘制,以此计算出半效浓度(IC50,μg/ml)和各个有效作用浓度下的细胞增殖抑制率(Inhibition rate)。同时制备大鼠正常骨髓细胞,考察FDE对大鼠正常骨髓细胞的影响。筛选出对FDE最敏感细胞株,并对其展开进一步的凋亡机制的研究。2.2呋喃二烯诱导MGC-803细胞凋亡机制研究通过体外抗肿瘤实验筛选,选出FDE对MGC-803细胞的抑制作用最佳。为进一步探讨其作用机制,本实验采用方法包括:①采用MTT法检测不同浓度不同药物作用时间对MGC-803细胞的抑制增殖的影响;②倒置显微镜观察细胞形态的变化,Hoechst 33242染色法结合结合荧光显微镜观察细胞凋亡形态变化;③Annexin V-FITC/PI双染法结合流式细胞仪检测细胞凋亡;④DCFH-DA荧光探针结合流式细胞仪检测细胞活性氧水平;⑤罗丹明123染色法合用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化;⑥PI染色法结合流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响;⑦Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性试剂盒结合分光光度计检测OD值的方法,通过OD值变化检测受试细胞裂解液中Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性的变化。2.3呋喃二烯体内抑制MGC-803细胞生长效应的评价根据体外筛选结果筛选出对喃二烯最敏感的MGC-803细胞株进行体外扩增,制备成细胞浓度为5×107个/ml的单细胞悬液,取此单细胞悬液的0.2ml,接种于多只4-6周龄BALB/c-nu/nu雄性裸鼠右前肢腋部的皮下,由此建立裸鼠移植瘤模型并开始检疫观察。建立模型成功后,选取40只移植瘤生长状态较好的裸鼠,测量肿瘤体积称量体重,随即建立空白对照组、FDE是药物实验组、阳性对照组并开始给药。各组均采取尾静脉注射的给药方式,隔日采用电子天平称量裸鼠体重、游标卡尺测量移植瘤的长短径,同时设置实验动物观察期,观察FDE对该敏感细胞株MGC-803裸鼠移植瘤生长的抑制作用,直至给药结束。给药结束后测量移植瘤体积,处死实验动物,剥离取出瘤块称重并拍照。依据肿瘤的相对体积、瘤重的变化评价药物的疗效,依据裸鼠的体重变化评价药物的安全性,应用Graphpad Prism5.0统计软件进行数据处理和统计学分析。3研究结果3.1呋喃二烯抗肿瘤筛选结果FDE对受试细胞的体外增殖抑制肿瘤实验结果表明,受试药物设置浓度基本涵盖了药物效应窗口,重复试验结果基本一致。FDE对肺癌、肝癌、宫颈癌、结肠癌、胃癌、人黑色素瘤和个别白血病细胞均呈现较好的生长抑制作用,药物与肿瘤细胞作用48小时,半效浓度(IC50)在16.58~55.30μg/ml,P<0.05。其中对人胃癌细胞MGC-803作用最强,IC50为16.58μg/ml。但FDE对白血病细胞Reh、THP-1和卵巢癌细胞SKOV-3不敏感,抑制作用(IC50)分别为187.19μg/ml、239.5μg/ml、206μg/ml。FDE在40μg/ml浓度以下,对正常大鼠骨髓细胞无抑制作用。同时设置阳性对照药5-氟尿嘧啶25ug/ml的固定作用浓度,同时对受试细胞株作用48h后显示其细胞增殖抑制率,范围为11.29%~91.46%。3.2呋喃二烯诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡的机制初探①MTT结果显示,FDE可明显抑制人胃癌细胞MGC-803的增值并诱导其凋亡。随着FDE浓度增加和作用时间的延长,对MGC-803细胞的抑制作用增强,具有时间和剂量依赖性。②普通光学显微镜下观察,随着FDE浓度的增加,MGC-803细胞出现明显的形态改变,细胞碎裂、染色质浓缩,同时细胞数量明显减少。Hoechst 33242染色结果显示,随着药物剂量的增大,蓝色荧光明显加深且数量增多,可以看到凋亡细胞的细胞核呈致密浓染。③通过Annexin V-FITC/PI双染后利用流式细胞仪检测,检测结果显示对照组中正常细胞占较大百分比,而80μg/ml FDE组中正常细胞变少,凋亡细胞数变多,平均凋亡率为24.17±4.24%,并且其差异具有统计学意义(P<0.05)。④DCFH-DA结果显示,随着FDE浓度的增大,细胞内ROS水平升高,当药物浓度为80μg/ml时,活性氧水平是未加药组的1.35倍。⑤经罗丹明123染色法检测线粒体跨膜电位变化,结果表明在FDE药物组作用48h后,人胃癌细胞MGC-803线粒体中的罗丹明123的蓄积量开始呈现出不同程度的下降,下降趋势随药物组剂量的增大而越发显著(P<0.01)。⑥PI实验结果表明药物实验组G0/G1期细胞明显增多,G2/M期和S期细胞均减少,人胃癌细胞MGC-803在FDE的作用下明显改变了周期的分布,与对照组相比G1期的细胞百分比增高明显,S和G2期细胞显著降低,将细胞阻滞在G1期。⑦Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性检测结果显示FDE明显提高了Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性,当终浓度分别为20、40、80μg/ml FDE作用之后Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的活性比对照组分别增高了(1.06、0.82、1.38)倍、(1.24、0.83、1.51)倍、(1.39、1.31、1.98)倍,与对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。3.3呋喃二烯体内抑制MGC-803细胞生长药效学评价FDE对受试动物的体内生长抑瘤效应的评价显示,高、中和低剂量组对MGC-803裸鼠移植瘤的抑瘤率分别为:33.00%(P<0.05)、27.99%和23.88%。通过观察肿瘤的生长曲线,可以看出与对照组相比,荷瘤裸鼠肿瘤的生长速度在给药后有减慢的现象,且随着FDE药物剂量的增大而变缓,肿瘤体积逐渐变小,但其抑瘤率不明显。各实验组内的裸鼠生长情况稳定,整个实验过程均未出现死亡个体。阳性对照药5-氟尿嘧啶组裸鼠均呈现出体重相对减轻的情况,FDE实验组的裸鼠体重则表现为增加,与空白对照组相比未出现明显变化。4研究结论4.1通过18种瘤细胞的抗肿瘤筛选,呋喃二烯在体外均表现出了较好的抗肿瘤作用,且具有良好的浓度依赖性。该结果为其在体外抑制瘤细胞作用机制的研究提供前提。4.2呋喃二烯能抑制人胃癌MGC-803细胞增殖和诱导凋亡,且具有浓度与时间依赖性。人胃癌MGC-803细胞的凋亡机制可能为线粒体途径启动、细胞周期发生G1期阻滞。呋喃二烯抗肿瘤作用机制与上调细胞凋亡的特异性标志Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表达与其信号传导促使细胞凋亡有关。4.3呋喃二烯体内抑制MGC-803细胞生长作用结果显示其体内抗肿瘤活性不明显,但在实验设定的剂量范围内是安全、低毒的,说明呋喃二烯要开发成一种新的抗肿瘤药物还有待于进一步实验研究探明。