Usher综合征是最常见一种由于基因突变而造成失明和失聪。临床上分为三种类型, Usher I型, Usher II型, Usher III型,其中II型是最常见的类型，大约占所有病例的70%。USH2A,USH2C和USH2D三个基因缺陷会导致USH2。在视网膜感光细胞的连接纤毛和内耳耳蜗毛细胞里，这三个蛋白组成复合体。在体内，已经证实许多蛋白都与USH2蛋白存在相互作用,说明这些蛋白极有可能是USH2复合体里的组成蛋白之一，编码这些蛋白的基因也极有可能是USH2基因候选基因之一。但是，复合体的生物功能和由于这个复合体的缺陷导致Usher综合征II型的机制还仍不是很清楚。在本次研究中，我们证明了espin和USH2D（whirlin基因编码蛋白）的直接关系。并证实这种直接相互作用关系对肌动蛋白束偶联espin的形态非常重要。Espin在视网膜感光细胞里的表达以及espin在whirlin敲除小鼠里蛋白表达的改变对USH2疾病的发病机制都提供了重要的线索。基于USH2蛋白的预测功能域，根据USH2蛋白在视网膜感光细胞和耳蜗毛细胞里的定位, USH2突变小鼠的表型，以及对USH2疾病类似疾病相关知识的了解,我们提出USH2复合体可能的生物功能。并且,对Usher综合征疾病的治疗方法进行积极地探索。方法：用酵母双杂交的方法，我们发现了whirlin和espin的相互作用。Espin是一个与肌动蛋白结合及成束的蛋白，当该基因缺陷时会导致人类的耳聋。在体外培养的细胞，我们用免疫共沉淀和蛋白共定位实验证实了这两个蛋白质的相互作用。这两种蛋白质的多个区域之间亦都存在相互作用。当espin不与肌动蛋白相结合时是whirlin和espin存在相互作用的条件。在视网膜的感光细胞和内耳耳蜗毛细胞里，espin与whirlin部分共定位。在whirlin基因敲除小鼠体内,espin蛋白在视网膜的感光细胞和内耳耳蜗毛细胞里表达显著改变。进一步研究发现,在espin偶联肌动蛋白束上，whirlin增加espin和肌动蛋白的移动性,最终影响这些肌动蛋白束的直径。在whirlin基因敲除小鼠中,耳蜗的内层毛细胞静纤毛直径显著增粗。结果：1.Whirlin与Espin的相互作用酵母双杂交证明espin与whirlin有相互作用。为了进一步确认whirlin与espin的相互作用,我们用重组的whirlin和GFP荧光蛋白标记espin在HEK293里细胞进行免疫共沉淀实验，结果发现用whirlin抗体能够沉淀用GFP标记的espin。Whirlin和espin用不同的荧光标记，并转染到细胞中,通过对这两个蛋白信号的仔细观察，我们发现这两个蛋白部分共定位。尤其在细胞质弥漫信号中，whirlin和espin表现出很强的共定位，但共定位信号却不在espin的粗纤维上。这些范围内的Pearson系数(信号强度的相关系数)范围在0.7和0.9之间，whirlin和espin的部分共定位表明whirlin和espin很有可能存在相互作用。在whirlin转染的细胞里,并没有发现whirlin与actin细丝共定位。此外,在whirlin转染的细胞和野生小鼠的视网膜里，都未发现whirlin与actin有直接相互作用关系。这些结果表明,whirlin不与actin直接作用，而且亦没有与肌动蛋白结合及成束的活性。在espin单独转染的细胞里，我们用phalloidin染色，结果发现espin与肌动蛋白束偶联在一起。而在espin和whirlin共同转染的细胞里, espin的纤维结构仍然可以用phalloidin染色，但是,在这些espin/肌动蛋白束里，whirlin则表现出非常弱的信号。这表明当espin和actin微丝偶联在一起时，whirlin则与espin不存在相互作用关系。我们发现用cytochalasin D处理细胞后,GFP标记espin蛋白的量在免疫共沉淀实验中增加了四倍。这个结果与我们上述的共定位的结果是一致的。从而更加充分的证实了这样的一个观点：当espin与actin微丝不结合的时候，whirlin和espin存在相互作用。2.Whirlin的多个区域都与espin存在相互作用关系在HEK293细胞中，从espin片段的免疫共沉淀的结果中发现espin AR和PR与whirlin存在相互作用。在转染细胞中，这两个espin的片段也和whirlin共定位。令人惊讶的是,在espin ABM和whirlin双转染的细胞里，也可见espin ABM和whirlin共定位。这个结果提示我们espin ABM直接或者间接和whirlin相互作用。但由于espin WH2H和WH2L片段不与whirlin共定位,espin WH2区域抑制espin ABM和whirlin之间相互作用。3.视网膜感光细胞和耳蜗毛细胞里可见whirlin和espin部分共定位从小鼠视网膜免疫组化结果中，检测到espin蛋白质位于感光细胞的内节和突触末端(分别是内段层和外丛状层)。Whirlin位于视网膜感光细胞的连接纤毛。在耳蜗的毛细胞里，双染色可见espin蛋白信号是沿着整个静纤毛分布，whirlin则是在静纤毛的顶端部和基底部。综上所述, whirlin和espin的部分共定位表明这两种蛋白质在于毛细胞和感光细胞中极有可能存在相互作用。下面进一步证实这两种蛋白的相互作用。4.Whirlin敲除小鼠视网膜和耳蜗中espin表达的改变和野生鼠的视网膜相比，在whirlin敲除小鼠的视网膜里,espin3亚型的表达水平下降到10%,而espin4亚型的表达水平增加了大约十倍。而espin1亚型的表达无显著变化。这些数据显示whirlin与espins1–3亚型相互作用。和野生鼠的外层毛细胞相比，whirlin敲除小鼠的外层毛细胞的espin信号强度明显下降到野生鼠的30%。因此得出这样的结论：在whirlin基因缺失的条件下，视网膜和毛细胞里espin蛋白表达的明显改变，意味着这两种蛋白在小鼠体内这些组织中存在相互作用。5.Whirlin加速espin在细胞伪足肌动蛋白束上的移动以及whirlin加速espin偶联肌动蛋白束上actin的移动我们用GFP标记espin蛋白，进行了荧光漂白后的荧光恢复实验。在细胞伪足上，whirlin能够显著缩短espin在细胞伪足的恢复时间但不会影响espin的最终蛋白恢复百分比。表明在细胞伪足上，whirlin能加速游离的espin和结合肌动蛋白束的espin交换，从而间接消弱espin和肌动蛋白微丝之间的偶联。进一步研究whirlin对espin偶联肌动蛋白束的作用,我们用GFP标记actin做荧光漂白后的荧光恢复技术（Fluorescence Recovery AfterPhotobleaching–FRAP）实验，和只转染GFP-actin和espin的细胞相比，当whirlin，GFP-actin和espin三种质粒共同转染细胞,在细胞的细纤维上，FRAP荧光恢复达到饱和状态所需时间缩短了一半,而且荧光恢复达到饱和状态的最终百分比保持不变。6.在小鼠体内，whirlin基因的敲除导致小鼠耳蜗内层毛细胞静纤维直径增粗为了更好阐明espin蛋白在whirlin敲除小鼠体内的表达改变,我们测量了毛细胞静纤毛的直径，发现whirlin基因敲除小鼠的内层毛细胞直径显著增粗，而外层毛细胞直径未改变。所以得出这样一个结论：Espin和whirlin是维持野生鼠静纤毛正常直径非常重要的两个基因,而且他们在这一个功能上起截然相反的作用。结论：Whirlin与espin的相互作用以及这两种蛋白表达的平衡对视网膜感光细胞和耳蜗毛细胞的肌动蛋白网十分重要。肌动蛋白网的破坏会导致疾病的发生。Whirlin的突变和espin的突变都会导致视网膜变性和听力丧失。Espin是USH2蛋白复合体的蛋白之一，也很有可能是Usher综合征的候选致病基因之一。