食品和农产品安全是关系到国计民生的全球性重大问题，其中农产品农药残留超标的问题是社会关注的热点。目前国内的农药残留检测技术主要是色谱法和酶抑制法。色谱法依赖于昂贵的设备、样本处理复杂、专业要求高，不适用于快速现场检测。新兴的酶抑制法则可快速检测农药残留，且操作简单，现在广泛使用于农产品的农残检测，其主要原理是有机磷和氨基甲酸酯类农药可抑制乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7)的活性。但在实际使用中，酶抑制法主要存在两个问题，一是不同来源的AChE敏感性不稳定；二是从血液和组织中提取酶周期长、成本高，这些问题制约了酶抑制法的广泛应用。　　 研究发现，用于农药残留检测时，昆虫的乙酰胆碱酯酶在一定程度上比哺乳动物的更为敏感，其中，双翅目昆虫来源的AChE又要比半翅目和鞘翅目昆虫来源的AChE对有机磷或氨基甲酸酯类农药更为敏感。其中，家蝇的乙酰胆碱酯酶的敏感性和稳定性均高于其他物种来源的乙酰胆碱酯酶。另外，通过对乙酰胆碱酯酶进行分子进化，可以提高酶对抑制剂的敏感性，获得更佳的酶源。　　 自上世纪90年代起，多种来源的乙酰胆碱酯酶基因在大肠杆菌、杆状病毒、酵母、昆虫细胞、爪蟾卵母细胞、哺乳动物细胞甚至植物株系中成功获得了表达，以上表达系统中，毕赤酵母表达系统具有细胞密度高、蛋白表达量高、发酵稳定等特点，是其中应用前景最好的表达体系。　　 本研究克隆了家蝇乙酰胆碱酯酶的基因，根据所得序列进行三维建模，通过生物信息学软件进行分析，利用多点突变手段对重组酶进行分子进化，以期获得敏感性更高的突变体。使用毕赤酵母表达系统对原始AChE和突变体进行高效表达，并对表达产物进行酶学分析。研究中取得了以下成果：　　 1.通过RT-PCR技术从家蝇头部的总RNA中分离克隆到AChE基因的全长cDNA序列，序列分析显示该基因长2，067bp，编码79个氨基酸组成的先导肽和612个氨基酸的成熟蛋白。　　 2.将所得到的蛋白序列提交到Swiss-Model服务器，对家蝇AChE的三维结构进行建模，模板为果蝇的lqo9A基因，两者相似度85.589％，所得模型可靠。将获得的工程文件在Swiss-PdbViewer软件中打开进一步分析，模拟不同位点的氨基酸突变，确定对该蛋白的A262、Y327和I374位点进行了单一或组合突变，实施人工分子进化，测序验证分子进化完成。　　 3.构建了一系列家蝇乙酰胆碱酯酶基因及突变体的酵母真核表达载体，将家蝇乙酰胆碱酯酶基因及突变体的酵母真核表达载体电击转化毕赤酵母GS115中，得到了其各自表达菌株。进行条件优化，确定发酵条件为：接种量1％，转速280rpm，发酵温度30℃。通过甲醇诱导进行高效表达，获得AChE及其突变体。　　 4.对AChE及其突变体进行酶活测定，突变体酶活相对于原始AChE有不同程度的提高，其中突变体GDD的发酵单位达到了75.5U/ml，为原始AChE的3.5倍。　　 5.突变后的重组酶与底物的亲和力有不同程度提高，特别是三突变体GDD(突变位点为A262G、Y327D和I374D)对底物的亲和力较原始AChE提高较大，说明262、327和374三个位点对AChE的活性有较大的影响。　　 6.Ki及IC50的测定结果显示，突变后的AChE对七种农药的敏感性都不同程度得到提高。其中，单突变体A262G和Y327F对农药的敏感程度比较接近；双突变体GF和GD对三种农药的敏感性比相应的单突变体要高；三突变体GDD对灭多威的敏感性是突变前的16倍，对克百威和毒死蜱的敏感性均是突变前的14倍。　　 本研究获得的重组AChE可以用来对蔬菜、瓜果中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留进行检测，为发展新型酶法检测农药残留技术以及农药的设计和筛选提供了高效的酶源，在食品安全农药残留检测领域具有很大的应用价值。