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毕赤酵母是近十年来发展起来的一种真核表达体系,具有表达量高、培养成本低、产物可以分泌到胞外、糖基化程度适中等优点。但是外源蛋白的降解是毕赤酵母表达体系应用过程中的共性问题,严重影响目的蛋白的积累。恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)裂殖子顶端膜抗原-l (Apical Membrane Antigen-l,AMA-1)的第Ⅲ片段和裂殖子表面蛋白-1(Merozoite Surface Protein-1,MSP-1)组成的融合蛋白基因在毕赤酵母中重组表达出的融合抗原,也称恶性疟原虫裂殖子融合蛋白2.9(PfCP2.9),作为抵抗恶性疟原虫引起的疟疾一个候选疫苗抗原,这是由第二军医大学和上海万兴生物制药公司共同开发,正在接受WHO和PATH/MVI的评估。虽然重组疟疾疫苗抗原PfCP2.9的毕赤酵母分泌表达体系已经构建完毕,但抗原蛋白PfCP2.9易受酵母分泌的蛋白酶的影响而降解严重。因此,本课题的研究任务就是通过对发酵和纯化条件的优化,降低蛋白酶对目的蛋白PfCP2.9的影响,从而实现目标抗原的高表达和高度纯化。在研究发酵的过程中,对诸如温度、pH值、甲醇补加的速度和溶氧等发酵关键参数进行了评价和优化,并确定高效表达目标抗原的发酵条件为,诱导时pH6.5,温度为22℃,且在发酵培养物中加入终浓度为5mmol/L的EDTANa2时,获得的PfCP2.9蛋白的产量最高。收获发酵液后,依次经过疏水层析,切向流超滤脱盐,阴离子交换层析,阳离子交换层析和分子筛层析,可获得纯度大于98%的目的蛋白PfCP2.9。其中,第一步的疏水层析,是整个纯化步骤的关键。因为通过疏水层析,不仅捕获了目的蛋白,而且将目的蛋白和蛋白酶实现了有效的分离。为进一步推进该候选抗原PfCP2.9的研究,我们在GMP车间中将发酵与纯化工艺放大到了150L发酵罐的规模。发酵上清液中目的蛋白的表达量达到了约2.0g/L,每批次可以获得不低于50g纯度不低于98%的目的蛋白,纯化总得率大于50%。