论文部分内容阅读
类枯草杆菌蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶S8家族，广泛存在于各个物种中。在本研究中，作者使用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法克隆了龙葵类枯草杆菌蛋白酶SaSBT1全长cDNA，并在大肠杆菌中进行了原核蛋白表达与纯化。实验结果显示，SaSBT1蛋白酶的酶原在大肠杆菌中成功实现了表达，并在特定的pH下进行了自我活化。短时间的高温孵育可以明显地促进该酶的活化。在特性条件下活化之后的蛋白酶SaSBT1显示了对caspase-1/3/6底物Ac-YVAD-MCA，Ac-DEVD-AMC和Ac-IETD-MCA的高度活性，其Vmax值分别达到了10.99、3.95和1.05 nmol/min/μg，而其Km值分别为682.4、43.2和28.2μM，其酶动力学相关数值接近于动物中的caspase或先前报道的植物中与程序性细胞死亡相关的液泡蛋白酶VPE。与动物的caspase类似，SaSBT1对caspase-1底物Ac-YVAD-MCA的活性可以被相应的抑制剂Ac-YVAD-CHO有效抑制，然而不能被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制。上述发现证明先前众多研究者所观察到的植物中caspase-like活性至少部分可能来自植物的subtilase家族蛋白酶。与此同时，作者还研究了一系列的蛋白酶抑制剂、各种pH、以及各种盐浓度对SaSBT1的酶活性和其他生化性质的影响。
为了研究SaSBT1在植物体内的表达情况，作者构建了SaSBT1启动子与报告基因β-葡萄糖苷酸酶(GUS)融合基因植物表达载体，并转化龙葵，得到了转基因植株。GUS染色结果显示，SaSBT1的启动子特异地驱使GUS基因在转基因龙葵的茎幼嫩部位的表皮、叶脉以及茎表皮细胞等组织特异表达。RT-PCR结果显示SaSBT1 cDNA可以从茎、叶以及果实制备的cDNA中特异性地得到扩增，这一结果与GUS染色结果相吻合。在烟草BY-2细胞中超量表达SaSBT1，可以加速细胞在55℃热激处理之后的死亡速度。这表明，SaSBT1可能和动物caspase一样，在植物细胞的死亡过程中发挥作用。