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纳米医学是一个蓬勃发展的领域,极大地丰富和发展了纳米技术的内涵。近年来,各式各样的纳米材料不断被开发出来并应用到生物医学领域中去。这些纳米材料以其优异、独特的性能已经成为当前生物医学检测应用的前沿和热点。量子点和纳米磁性微球是目前纳米医学相关领域研究人员较为关注的热门纳米材料,基于其独特的光学或磁学特性,从疾病诊断到治疗不断有新的应用策略推出。
本论文主要从量子点和纳米磁性微球两种纳米材料入手,根据各自特性,设计、建立了一系列灵敏、特异、简便适用的生物医学检测方法,并用于蛋白和核酸的检测分析。主要研究工作包括如下4个方面:
1)在传统的纳米金粒子层析试纸条的基础上,对其结构进行了改造,采用量子点作为探针的标记物,设计制备了可检测梅毒钩端螺旋体抗体的量子点层析试纸条,利用anti-TP47多克隆抗体和临床收集的100份血清样本对其进行了评估并与传统的纳米金粒子层析试纸条进行了对比。结果显示,量子点层析试纸条具有比纳米金粒子层析试纸条更高的灵敏度,最低检测极限达到了2 ng/mL的anti-TP47多克隆抗体,与临床常用的TPPA(梅毒螺旋体明胶凝集试验)和FTA-Abs(荧光螺旋体抗体吸附试验)结果一致,且荧光信号强,稳定性好,可避免溶血反应造成的假阳性结果,在单靶点的定点即时检测上具有很大的应用潜力。
2)采用免疫渗滤模式设计了基于量子点生物探针的蛋白微阵列用于快速平行化检测血清中TORCH相关病原体的抗体,采用收集的100份妇产科随机门诊血清样本对其进行了临床评估,并与ELISA(酶联免疫吸附试验)检测方法进行了对比。实验结果显示,量子点蛋白微阵列与ELISA检测方法无显著差异,灵敏度和特异性达到了85%以上,与之对比更具有原理简单,制备方便,对检测设备要求不高,使用成本低,操作流程少,实验时间短,可多靶点平行检测的优势。结合前述的量子点层析试纸条,为单个靶点和多个靶点的快速筛查提供了一个灵活的定点即时检测方案。
3)合成制备了带有羧基的纳米磁性微球并设计表达了具有抗体结合和核酸内切酶两种功能的双功能蛋白,由此构建了一个液相检测体系用于检测口腔粘膜渗出液中的HBV(乙型肝炎病毒)表面抗体。该检测体系利用功能化的纳米磁性微球对样本中的靶抗体进行快速捕获和富集;利用双功能蛋白对纳米磁性微球捕获的靶抗体进行标记并通过特异性的酶切反应对FRET(荧光共振能量转移)核酸底物进行剪切由此放大检测信号。在模拟的HBV感染患者口腔粘膜渗出液样本的实验中可检出低至0.1 ng/mL的anti-HBs单克隆抗体,且在0.1 ng/mL至125ng/mL之间具有较好的线性关系。同时,该检测方法对待检样本的体积无要求,样本的利用度高,无需标记第二抗体,结合新颖的信号放大策略为唾液检测提供了新的思路。
4)结合巨磁阻抗传感器设计制备了基于纳米磁性微球的微流控芯片系统用于对HPV(人乳头瘤病毒)进行高危分型,采用收集的132份宫颈拭子样本对其进行了临床评估,并与DNA(脱氧核糖核酸)测序结果进行了对比。实验结果显示,该微流控芯片系统可检出低至4个拷贝的HPV16型阳性质粒,以DNA测序为金标准,其灵敏度和特异性均超过了95%,其中特异性均为100%。该微流控芯片系统成本低,对检测环境无特殊光学要求,操作简单,实验步骤少,检测时间短,可对HPV高危型16和18两型进行平行化分型,为基于磁学信号的生物医学检测提供了一个新的应用策略。