当分子被特定波长的入射光照射后,其电子从基态跃迁到激发态,在通过辐射返回基态并发射比入射光波长更长的光的过程中产生荧光,或称为光致发光。荧光探针是用于定位或响应生物样本特定区域中特定刺激的荧光分子,通常由荧光团,识别基团(受体)和间隔基团组成,常见的荧光团包括罗丹明、荧光素、香豆素和萘酰亚胺等。目前,荧光探针的识别机制主要包括:分子内电荷转移(ICT),光诱导电子转移(PET),荧光共振能量转移(FRET),激发态分子内质子转移(ESIPT),螺环开关机理(Spiroring-Open and Close)等。反应型有机分子荧光探针是一种基于分子识别和荧光分析有机结合的新技术,可通过化学反应对底物进行特异性识别和荧光标记,实现活细胞和生物体内的原位、实时检测,具有检测速度快,发光性能好,灵敏度高,选择性好,操作简便,成本低等优点,在环境分析、细胞染色、生物检测等领域具有良好的应用前景。小分子生物硫醇具有独特的化学反应性,在维持生命体系的稳定中具有至关重要的作用,半胱氨酸(Cys)、高半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)是其中的代表性分子。其中,Cys具有维持蛋白质结构和功能的作用,Cys缺乏会导致儿童生长缓慢,毛发脱色,肝损伤,肌肉和脂肪损失,皮肤损伤等多种综合征;Hcy与机体生化水平密切相关,体内Hcy浓度异常会导致阿尔茨海默氏症,心血管疾病以及叶酸和维生素B12缺乏等多种疾病;GSH是体内含量最多的生物硫醇小分子,主要功能为维持细胞内的氧化还原活性,异质代谢,信号传递和基因调控等。因此,对生物硫醇进行高灵敏度和高选择性的检测,并探究其在生理病理的生物活性对生化研究及临床诊断具有非常重要的意义。用于检测小分子生物硫醇的经典方法包括质谱,毛细管电泳,高效液相色谱和电化学分析等,但这些方法所需的检测设备复杂,成本高,容易损坏样品,并且只能检测生物硫醇的总量,检测时间长。近年来,荧光探针技术在生物硫醇检测和活细胞标记方面取得了很大进展。然而,这些探针中的有些结构非常复杂且难以合成;有些探针不具有足够的水溶性或选择性,难以实现实际应用;一些探针在活细胞中具有较差的膜穿透能力,因此难以应用于生物体内的检测;大多数反应型荧光探针通过与分析物的不可逆化学反应来发挥其功能,标记的分析物不能被回收,并且容易对活生物体或活细胞造成损害。因此,开发可逆并且对生理系统没有损害的荧光探针是生物硫醇标记领域的主要趋势。目前,在据报道用于检测小分子生物硫醇的探针中,基于氧杂蒽结构和二硫化物裂解硫醇的荧光探针相对较少。结合荧光探针和硫醇分子识别的基本原理,本文的主要研究目的是设计基于荧光素和罗丹明两种荧光团的二硫化物荧光探针FLDP-1,RHDP-1,RHDP-2和RHDP-3,以及相应的氟化物,通过硫醇-二硫化物交换反应,实现高效、可逆的蛋白质表面半胱氨酸残基的标记。通过核磁共振和高分辨率质谱等相应的检测手段进行结构表征,通过紫外检测器和荧光探测器等相应的分析手段对其吸收光谱和荧光光谱进行了研究。同时,通过设计探针与生物硫醇分子Cys的反应,探究了探针分子的实用性。二硫化物可用于标记具有暴露的半胱氨酸残基的遗传编码的蛋白质,或标记变性蛋白质中的所有Cys-SH。相对于不可逆的共价硫醇标记,本文中探针的优点是被标记的蛋白质可以通过用还原剂或过量的不同硫醇处理来再生,这对于检测活细胞中的硫醇水平很重要。在我们的设计中,荧光探针的游离巯基形式是非荧光的,其原因是激发态的振动失活。荧光素在单阴离子“OH”形式中荧光较低,但在双阴离子形式中荧光较强,由于我们的分子没有羧酸基,为单阴离子。同时,附着于荧光团的S-H键的存在导致激发态的振动弛豫,意味着没有荧光发射。优点是可以对标记的蛋白质进行测量而不去除游离巯基,简化了实验步骤。与此同时,混合二硫化物应具有与探针相同的荧光性质,并且最好是混合二硫化物的荧光不依赖于局部环境。荧光素及其衍生物是一类重要的荧光材料,具有量子产率高,摩尔吸光系数大,可见光范围内的激发和发射,水溶性好,在水溶液中具有强度较高的发射峰等优点,其探针已广泛应用于离子检测和生物成像等各种领域。荧光素分子由苯环和氧杂蒽环两个p-共轭体系组成,其中氧杂蒽环为发色团。当两个共轭体系的电子云相互作用较弱时,它们具有相对垂直的结构;然而,苯环在溶液中会发生热旋转,使这两部分改变原始的垂直结构,增加电子云的重叠程度。荧光素分子存在内酯型和醌型两种共振结构,具有“开-关”环特性:其处于内酯结构时,氧桥将氧杂蒽环和苯环键合在一个平面上,因此分子具有刚性共平面结构,这不利于荧光的产生;当荧光素探针与被分析物(如Cu~+,Hg~+,氨基酸,蛋白质等)反应后,内酯结构变为醌型,可以实现荧光的开启。基于已报道的荧光素分子的合成方法,我们选择3,6-二羟基-9H-黄嘌呤-9-酮和4-溴苯硫酚作为合成FLDP-1的底物。关键步骤是选择合适的保护基团以保护巯基,使脱溴剂不与硫醇基团反应,然后进行适当的脱保护反应以除去保护基团,得到荧光素硫醇分子,进一步氧化得到二硫化碳探针。首先,我们需要确定合适的脱溴剂。以甲基作为巯基保护基,使用格氏试剂如异丙基氯化镁(i-Pr Mg Cl)和锂化试剂如正丁基锂(n-Bu Li)和叔丁基锂(t-Bu Li)进行了一系列实验。结果显示,如果使用n-Bu Li作为脱溴剂,则在反应结束后得到产物和副产物的混合物,其中大部分为副产物且难以分离。使用i-Pr Mg Cl作为脱溴剂,产物的收率非常低且反应不完全。因此,我们使用t-Bu Li作为最终的脱溴剂来进行合成反应。t-Bu Li是一种常用的进行卤素-锂交换反应的锂化试剂,其反应性能比一般的格氏试剂更广泛,更多样化。我们最初使用四丁基溴化铵(TBAF)作为去除TBS保护基团的方法。然而,实验发现使用TBAF分解硅醚后,有时难以通过柱色谱或HPLC清除所产生的铵离子,并且季铵盐的质谱响应特别强,会干扰质谱。因此,采用HCl(aq)来淬灭反应,并通过过滤收集所得的橙色沉淀物。在确定合适的脱溴剂后,我们进行了一系列实验以选择硫醇基团的保护基。作为保护基团,它应具有温和的反应条件,稳定的性质,无其他副反应,并且在反应完成后易离去等特点。常用的硫醇保护基包括甲基,苄基,2-甲氧基乙氧基甲基(MEM),4-甲氧基苄基(PMB)等。我们使用上述四个保护基合成了相应的产物,并通过一系列脱保护实验,最终选择MEM作为巯基的保护基。并使用HCl作为脱保护试剂,结果表明,反应后的硫醇探针非常活泼,可被空气中的氧气快速氧化成二聚体形式,即基于荧光素的二硫化物探针FLDP-1。在获得探针FLDP-1后,我们发现其量子产率非常低,为0.02,用TCEP处理得到硫醇,其量子产率测量为0.31,这个结果与我们的设计完全相反。我们认为荧光素硫醇化合物易被氧化的原因是芳环向硫原子提供电子,产生非常活泼的硫原子,使其在空气条件下被氧化成二硫化物。因此,设想向芳环中加入吸电子基团使芳环减少向硫原子提供的电子,从而产生稳定的荧光素硫醇衍生物。基于上述研究,我们设计了在芳环上带有吸电子基团F的荧光探针FLDP-2,然而,二氟荧光素硫醇FLDP-2和其副产物难以通过常规柱色谱分离,我们只能得到两者的混合物。尽管如此,由于氟原子的引入,我们发现硫醇的稳定性增加,并且氧化成二硫化物的时间变长,这为我们在未来设计稳定的硫醇提供了新的思路。罗丹明与荧光素分子结构相似,都属于氧杂蒽类染料。从结构的角度来看,具有无色闭环内酯结构和粉色开环离子结构,由于氧杂蒽环通过氧桥连接,具有良好的刚性共面结构,因此罗丹明荧光分子具有摩尔吸光系数大,量子产率高等特点。自第一个罗丹明有机荧光探针报道以来,它就受到了研究者们的高度关注,现已广泛应用于细胞成像和荧光标记等多个领域。与荧光素分子类似,罗丹明也是构建“OFF-ON”型荧光探针的理想前体。这种探针本身荧光较弱,当某些底物与罗丹明发生反应后,内酯环被打开并伴随着很强的荧光变化。近年来,已有许多罗丹明衍生物被用于检测生物硫醇分子。然而,目前还没有一种可逆的罗丹明荧光探针用于溶液或活细胞中生物硫醇的检测。根据已报道的罗丹明分子的合成方法,我们选择3,6-双(二烷基氨基)-9H-黄嘌呤-9-酮和4-溴苯硫酚作为合成RHDP的底物。选择MEM作为硫醇基团的保护基,t-Bu Li作为脱溴剂,进行罗丹明探针的合成。当进行MEM脱保护实验时,溶剂由甲醇替换为1,4-二氧六环,可以在不存在单体硫醇的情况下直接获得二硫化物产物。在探针合成后,我们测量了其荧光性质,发现RHDP-1,RHDP-2和RHDP-3的量子产率分别为0.32,0.30和0.29。当测量相应硫醇的荧光时,向RHDP溶液中加入适量的三(2-羧乙基膦)(TCEP),通过LC-MS监测二硫化物是否完全转化为硫醇,然后进行测量,结果显示RHDP-1,RHDP-2和RHDP-3的硫醇量子产率分别为0.03,0.04和0.09,该结果与我们先前的二硫化物荧光探针设计一致。合成罗丹明二硫化物荧光探针RHDP后,我们尝试合成二氟罗丹明硫醇,由于罗丹明硫醇分子的量子产率低,因此通过引入两个氟原子作为吸电子基团来获得稳定的非荧光罗丹明硫醇分子。结果发现没有二氟罗丹明硫醇产物生成,直接得到了二氟罗丹明二硫化物RHFDP。通过探针与N-乙酰-L-半胱氨酸的反应,研究标记半胱氨酸的可行性。结果表明,探针可与N-乙酰-L-半胱氨酸反应形成罗丹明-半胱氨酸的混合二硫化物。然而,我们尚未成功分离出混合二硫化物,需要进一步确定其荧光性质。本论文的工作只是基础,提供了一种标记半胱氨酸的新型可逆荧光探针的可能性。荧光素和罗丹明探针与体外或活细胞硫醇的标记效应,以及如何实现探针的可逆性,还有待进一步的实验研究。将来,我们将通过更合理的设计,研究二硫化物荧光探针的结构与其荧光特征之间的关系以及识别生物硫醇的能力,设计和开发具有更强水溶性的二硫化物荧光探针。在本文中,我们仅选择了两种荧光团,即荧光素和罗丹明制备二硫化物探针。理论上,其他荧光团也可以通过分子设计合成相应的探针,从而获得二硫化物探针体系,这对于检测生物硫醇具有重要的意义。