中药是一种典型的复杂体系,了解其化学成分是深入研究中药的作用机制,促进中药的现代化的基础。然而,由于其复杂性,只使用一种分离技术往往不能达到很好的分离效果,因此,探索分离效果更好的策略成为中药研究领域至关重要的课题。二维色谱由于其峰容量远超一维分离而成为复杂中药成分研究的选择之一,在中药复杂体系的分离上有很大的发展空间。由于能在两维提供几乎完全相反的分离机理,高正交组合二维系统(如反相×亲水色谱组合)理论上可以实现如中药这样的复杂体系的高效分离,然而,两维溶剂的高度不兼容问题限制了这种组合二维色谱的应用。因此,本研究着眼于解决高正交组合两维溶剂不兼容的问题。通过综合采用第一维脉冲梯度洗脱、捕集柱技术、在柱稀释调制3种辅助技术相结合,构建了一种既克服了溶剂不兼容问题,又可以实现两维分离自由调节的反相×亲水相互作用色谱(RPLC×HILIC)全二维系统。为了验证所构建系统在复杂中药分析的应用,选择具有代表性中药三七、党参和桔梗作为分析对象,在系统地优化各项分离条件的基础上,与质谱检测器进行联用,实现了三种中药的组分高效分离及在线鉴定。具体研究如下:1.首先,以同时具有亲水基和疏水基的三七中皂苷类成分作为分析对象,通过调节第一维RPLC脉冲洗脱梯度、第二维HILIC分离梯度、转移馏分的稀释因子、柱上调制时间、第二维柱平衡时间和第二维流速等因素,对新发展的多辅助技术调制的RPLC×HILIC全二维系统进行了全面优化以验证其在克服溶剂不兼容和两维自由调节上的优势。并在两个维度的优化条件下,对比了传统的标准调制和固定溶剂调制策略的二维系统对三七皂苷的分离效果,结果显示采用本研究提出的调制策略对二维系统在分离效果上具有显著优势。最后,在优化的条件下,将构建的RPLC×HILIC系统与三重四极杆质谱串联,对分离后的三七皂苷进行了质谱分析,并将收集到的MS1、MS2数据与报道中的参考文献进行了对比,成功鉴定出41种皂苷类成分。2.党参中的大多数成分,如炔苷类和苯丙苷类等化合物,它们的结构中均含有亲水和疏水基团。这类双亲型的化合物非常适合于采用RPLC×HILIC系统进行分离。因此,本研究第二部分以党参作为样品进一步验证所构建的多辅助技术调制的RPLC×HILIC系统分离性能。通过调节提取溶剂、第一维RPLC脉冲洗脱梯度、第二维HILIC分离梯度、转移馏分的稀释因子等对二维分离起关键作用的因素,对系统进行了细致的优化。结果表明采用多辅助技术调制策略的全二维系统具有显著的优势。最后,将优化的RPLC×HILIC系统与三重四极杆质谱联用。通过对党参提取物中的化学成分进行在线质谱分析,并将收集到的MS1、MS2数据与已报道参考文献中相关质谱信息进行了对比,共鉴定出46种化合物。3.桔梗主要活性成分之一为齐墩果烷型三萜皂苷,同时具有亲水性基团(糖)和疏水性基团(母核),同样非常适合采用RPLC×HILIC系统进行分析,因此我们以构建的新型全二维系统对桔梗中组分进行了系统的分离及在线鉴定研究。桔梗提取液经过固相萃取后得到待分析样品,通过优化两维分离条件以及调制参数,成功的实现桔梗中双亲型化合物的高覆盖度分离。通过将优化的RPLC×HILIC全二维系统与三重四极杆质谱联用,成功的实现桔梗双亲型化学组分的质谱分析。将收集到的MS1、MS2数据与参考文献中质谱鉴定结果比对,成功鉴定出32种化合物。通过对三种植物药材的高效分离及在线鉴定研究,结果表明本文中所建立的多辅助技术调制RPLC×HILIC全二维系统是一种在中药分析领域具有广阔应用前景的多维分离技术。