背景:结直肠癌是人类常见的消化道恶性肿瘤，其发病率在我国呈快速上升趋势。除了手术及放化疗，靶向治疗已成为结直肠癌第四大治疗手段。但是在应用这些靶向药物的过程中会产生抗药性及并发症，尤其是耐药问题制约了靶向药物的发展，使得靶向药物的应用遇到了“瓶颈”。现已证实肿瘤是个“分子网络病”，各个信号途径间有着直接或间接作用，阻断其一支可能引起其他途径的激活，多靶点抑制即靶向药物联合应用成为了研究热点。VEGF类靶向药物和EGFR类靶向药物的联合结果使患者PFS（无进展生存期）缩短，毒性明显增加。因此有学者提出开发新的靶向药物和传统靶向药物联合应用的效果会优于单用传统靶向药物，并且还可能会降低耐药及毒副作用的发生的机率。　　近年来c-Met途径受到越来越多的关注。目前在治疗非小细胞肺癌方面，c-Met抑制剂在国外已经进入Ⅲ期临床试验阶段。单独应用c-Met抑制剂可以抑制非小细胞肺癌等多种肿瘤的增长，且其与传统靶向药物联合应用可以产生协同作用并降低传统靶向药物的耐药性。但关于c-Met抑制剂在结直肠癌中与传统靶向药物联合的文献较少，意义尚不完全明确。c-Met信号可以通过MAPK/ERK1/2和PI3K/Akt信号通路发挥作用促进结肠癌细胞的增殖和侵袭，其信号通路与传统靶向药物的信号途径可能有交互作用。我们推测c-Met抑制剂联合传统靶向药物抑制结直肠肿瘤的效果要优于单用传统靶向药物且联合用药能够降低传统靶向药物的耐药及毒副作用。本研究目的即观察c-Met抑制剂PHA-665752联合贝伐单抗或西妥昔单抗对结肠癌移植瘤生长的影响并探讨可能的机制。　　目的:探讨c-Met抑制剂联合贝伐单抗或西妥昔单抗对结肠癌移植瘤生长的影响及相关机制。　　方法:　　1造模　　清洁级环境里饲养4-5周龄的裸鼠（雄性）并培养足量的HCT116细胞（购于中国科学院细胞库），用培养的HCT116细胞制成细胞与PBS的混合液，浓度为5.5×107/ml。每只模型用0.15ml的细胞混合液(7-8×106)注射，部位是模型鼠的肋腹部（统一为左侧皮下层），等到注射后的第4天大部分模型可以看到移植瘤，造模完成。　　2将模型分成六个组　　等到注射的移植瘤生长到直径0.6cm时，按随机的原则将模型鼠分成六个组，8只模型鼠为一组。六组分别为:DMSO组（对照组）、贝伐单抗组、西妥昔单抗组、PHA-665752组、PHA-665752联合贝伐单抗组、PHA-665752联合西妥昔单抗组。PHA-665752及DMSO隔日腹腔给药一次，西妥昔单抗及贝伐单抗每周腹腔给药二次，疗程4周。　　3移植肿瘤生长情况的检测　　每天观察裸鼠的生活状态及移植瘤情况，待裸鼠皮下肿瘤生长到长径约0.6cm时，开始测量肿瘤的长短径计算体积(π×长径×短径2/6)并记录裸鼠重量，每四天一次。　　4模型鼠分别用三种靶向药物腹腔注射治疗32天，然后使用水合氯醛将模型鼠麻醉过量致其死亡。精确解剖留取移植瘤，最后用10％福尔马林固定。　　5 HE染色观察形态结构变化，Tunel试剂盒检测凋亡情况。免疫组织化学法分别检测移植瘤中caspase-3、vimentin及CD31的表达情况。　　结果:　　1 PHA-665752联合贝伐单抗或西妥昔单抗对裸鼠一般情况的影响　　用药后各组小鼠饮食量、活动及体重无明显差别，体重一直持续增长至实验结束。　　饲养过程中DMSO组移植瘤第2周开始出现溃破，单纯PHA-665752组第3周开始出现溃破，西妥昔单抗组第四周出现溃破，贝伐单抗组及联合用药组未出现移植瘤溃破的情况。　　2 PHA-665752联合贝伐单抗或西妥昔单抗对裸鼠结肠癌移植瘤生长情况的影响　　根据每次测量的肿瘤长短径计算体积(π×长径×短径2)/6绘制肿瘤生长曲线，了解肿瘤的生长情况。　　2.1实验结束时，贝伐单抗组、PHA-665752组、PHA-665752联合贝伐单抗组、肿瘤体积均小于MODS组（P＜0.01）;PHA-665752联合贝伐单抗组肿瘤体积小于单用贝伐单抗组（P=0.033）、其余两两比较均有统计学差异(P＜0.01)。　　2.2实验结束时，西妥昔单抗组、PHA-665752组、PHA-665752联合西妥昔单抗组肿瘤体积均小于MODS组（P＜0.01）;PHA-665752联合西妥昔单抗组肿瘤体积小于单用西妥昔单抗组（P＜0.01）;单用西妥昔单抗组前3周的肿瘤体积小于PHA-665752组（P=0.011），但是单用西妥昔单抗组第4周的肿瘤体积与PHA-665752组之间没有差异(P=0.633);其余两两比较后均有统计学上的差异(P＜0.01)。　　3 HE染色结果　　在OLYMPUS BX61全能显微镜低倍镜下可以看到联合用药组肿瘤组织大片坏死伴炎性细胞浸润，单独用药组坏死较少，DMSO组最少，各组间有明显差异。　　4 PHA-665752联合贝伐单抗或西妥昔单抗对裸鼠结肠癌移植瘤凋亡的影响　　我们采用Tunel法检测了各组肿瘤细胞凋亡的情况。肿瘤凋亡细胞胞核被染成棕黄色。首先在OLYMPUS BX61全能显微镜（低倍）找到客观且有代表性的区域，调转显微镜到高倍，选择5个有代表性的区域计算凋亡细胞的个数，计算AI值并进行统计学分析。　　贝伐单抗联合PHA-665752组、贝伐单抗组、PHA-665752组、DMSO组AI平均值分别为:（29.40±2.97）％、(18.60±2.97)％、（12.40±3.51）％、（3.60±2.07）％。各组间两两比较后均具有显著统计学上的差异（P＜0.01）。　　西妥昔单抗联合PHA-665752组、西妥昔单抗组、PHA-665752组、DMSO组AI平均值分别为（20.60±2.40）％、(7.20±1.92)％、（12.40±3.51）％、（3.60±2.07）％。西妥昔单抗组与DMSO组比较有统计学差异（P＜0.05），其余各组间两两比较后均具有显著统计学差异（P＜0.01）。　　5 PHA-665752联合贝伐单抗或西妥昔单抗对裸鼠结肠癌移植瘤凋亡因子caspase-3表达情况的影响　　以caspase-3作为肿瘤凋亡细胞的标志物，肿瘤凋亡细胞胞浆被染成棕黄色。　　贝伐单抗联合PHA-665752组、贝伐单抗组、PHA-665752组、DMSO组IHS评分平均值分别为:7.80±1.64、5.40±1.38、3.00±2.12、0.60±1.34。各组间两两比较后均具有统计学上的差异(P＜0.05)。　　西妥昔单抗联合PHA-665752组、西妥昔单抗组、PHA-665752组、DMSO组IHS评分平均值分别为5.40±1.34、0.80±1.09、3.00±2.12、0.60±1.34，西妥昔单抗组与DMSO组无统计学差异（P＞0.05）;其余各组间两两比较后均有统计学上的差异(P＜0.05)。　　6 PHA-665752联合贝伐单抗或西妥昔单抗对裸鼠结肠癌移植瘤EMT相关因子vimentin表达情况的影响　　以vimentin作为EMT肿瘤细胞的标志物，EMT肿瘤细胞的胞浆被染成棕黄色。　　贝伐单抗联合PHA-665752组、贝伐单抗组、PHA-665752组、DMSO组IHS评分平均值分别为:2.20±1.30、4.60±1.37、5.40±1.30、9.60±1.31。贝伐单抗组与PHA-665752组无统计学意义(P＞0.05)，其余各组间两两比较后均具有统计学上的差异（P＜0.05）。　　西妥昔单抗联合PHA-665752组、西妥昔单抗组、PHA-665752组、DMSO组IHS评分平均值分别为2.40±1.34、5.00±1.41、5.40±1.30、9.60±1.31，西妥昔单抗组与PHA-665752组无统计学差异(P＞0.05)，其余各组间均有显著统计学差异(P＜0.01)。　　7 PHA-665752联合贝伐单抗对裸鼠结肠癌移植瘤形成新生血管的影响　　用CD31为标志物，被染色的即为血管的内皮细胞，可以看到其胞浆被染色后变成棕黄色。在OLYMPUS BX61全能显微镜（低倍）找到客观且有代表性的区域，调转显微镜到高倍，选择5个有代表性的区域并数出微血管数量，计算出5个区域的微血管平均值，即微血管密度(microvessel vessles density，MVD)。贝伐单抗联合PHA-665752组、贝伐单抗组、PHA-665752组、DMSO组裸鼠肿瘤MVD平均值分别为1.40±0.55、3.00±0.71、5.40±1.14、10.00±1.58。贝伐单抗联合PHA-665752组与贝伐单抗组两组之间的MVD比较结果有统计学意义的差异（P=0.031），其余两两比较MVD，结果也都具有统计学意义上的差异性(P＜0.01)。　　我们还可以看到DMSO组新生血管密集，且杂乱无章，形状不规则，呈高度扩张状态，贝伐单抗组及其与PHA-665752组联合组新生血管少，管型规则，单用PHA-665752组血管数量及血管管型规则程度则介于两者之间。　　结论:　　1 MET抑制剂对贝伐单抗有增敏作用且不受KRAS状态影响;　　2在KRASpG13D突变型结直肠癌中MET抑制剂可以克服西妥昔单抗的原发抵抗;获得性抵抗可能与MET代偿性上调关系密切;　　3 PHA-665752联合传统靶向药物没有增加药物的毒副作用。