前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是欧美男性生殖系统常见的恶性肿瘤,其死亡率位居男性恶性肿瘤的第二位。近年来,随着血清前列腺特异性抗原(Prostate specific antigen,PSA)筛查的逐步推广,前列腺癌发病率快速上升,正日益成为严重威胁我国老年男性健康的疾病。目前临床治疗的重大挑战之一是如何在前列腺癌中区分哪些肿瘤生长缓慢,哪些肿瘤可能迅速进展,威胁生命。即如何判定肿瘤的"惰性(indolent)"与"侵袭性(aggressive)",并在此基础上进行个体化治疗。目前,前列腺癌的过度诊断和过度治疗非常严重。现在普遍应用的临床病理学参数:Gleason评分,PSA水平,以及临床病理分期等尚不能很好的判断预后。因此,基于分子分型基础上,对前列腺癌病人进行危险分级,来区分惰性以及侵袭性肿瘤,从而进行精准治疗,对前列腺癌的诊治至关重要。异柠檬酸脱氢酶(Isocitrate dehydrogenase,IDH)是体内物质代谢的关键酶,可以催化异柠檬酸转化成α酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG),同时增加NADPH的产生。很多肿瘤中都存在异柠檬酸脱氢酶,特别是IDH1/IDH2的突变,这种可能的原癌性质的突变可以改变细胞内代谢,产生异常代谢产物以及广泛的表观遗传学改变。有研究表明,IDH1突变阳性前列腺癌患者代表一种独特的分子亚型(以IDH1R132H最常见),但其在前列腺癌发生发展中的作用尚不清楚。通过本研究发现,IDH1R132H在前列腺癌中的发生率在0.6%(2/336)。体外实验证实具有IDH1R132H的良性前列腺上皮细胞迁移能力更强,在低细胞因子情况下,有明显的增殖优势(前列腺癌细胞中的作用相反)。进一步的研究表明IDH1R132H可以通过表观遗传学修饰的改变抑制miR-141-3p,miR-7-5p,miR-223-3p的表达,从而使胰岛素样生因子受体1(Insulin-like Growth Factor 1 Receptor,IGF1R)表达水平升高,进而激活AKT/STAT3信号通路促使良性前列腺上皮细胞发生恶性转化。本研究首次较为系统的阐述了 IDH1R132H在良性前列腺上皮细胞中所发挥的作用以及作用机制,为IDH1R132H在前列腺癌中的诊治提供了一定的依据。研究目的:1、检测IDH1R132H在前列腺癌患者中的发生频度2、研究IDH1R132H在良性前列腺上皮细胞及前列腺癌细胞中所发挥的功能3、探讨IDH1R132H促进良性前列腺上皮细胞恶性转化的作用机制研究方法:1、检测IDH1R132H在前列腺癌患者中的发生频度及突变阳性前列腺癌患者的临床分子病理特征1.1免疫组织化学法初步筛查IDH1R132H在前列腺癌组织中的阳性病例。1.2将初步筛查得到的IDH1R132H阳性病例,通过石蜡组织提取DNA,PCR后进行测序分析,进一步确定IDH1R132H突变。分析IDH1R132H突变阳性前列腺癌患者的临床分子病理特征。1.3 一代测序检测前列腺癌及正常细胞系中IDH1突变情况。2、研究IDH1R132H在良性前列腺上皮细胞、前列腺癌细胞中的生物学功能2.1 慢病毒转染 RWPE-1、LNCAP 细胞,形成 IDH1R132H,IDH1WT,VECTOR稳定表达的细胞株,嘌呤霉素进行抗性筛选,Western Blot、RT-qPCR检测其表达效率。2.2MTS检测稳定表达IDH1R132H,IDH1WT,VECTOR后,细胞增殖能力的变化。2.3 Transwell及划痕实验检测稳定表达IDH1R132H,IDH1WT,VECTOR后,细胞迁移能力的变化。2.4 RT-qPCR检测前列腺癌干细胞以及分化相关指标CD133,CD44,α 2 γ 1,AR,PSA等的表达变化。2.5 AGI5198处理细胞后,MTS以及Transwell实验检测细胞的增殖及迁移能力的变化。3、探讨IDH1R132H促进良性前列腺上皮恶性转化的作用机制3.1 检测 IDH1R132H 所调控的 microRNA。1)MicroRNA芯片初步筛选IDH1R132H所调控的microRNA。2)RT-qPCR 验证 microRNA 的变化。3)染色质免疫共沉淀(ChIP)实验检测在microRNAs启动子区H3K4me3和H3K27me3富集情况。3.2IDH1R132H 通过下调 miR-141-3p,miR-7-5p,miR-223-3p 促进 IGF1R 的表达。1)Targetscan 软件预测 miR-141-3p,miR-7-5p,miR-223-3p 的共同靶基因。2)Western Blot及免疫荧光实验检测稳定表达IDH1R132H,IDH1WT,VECTOR后,IGF1R的蛋白表达水平。3)在稳定表达IDH1R132H的RWPE-1细胞中加入microRNA的mimic和阴性对照,Western Blot检测其靶基因IGF1R的变化。4)构建IGF1R-3’UTR荧光素酶报告基因表达载体,将microRNA的mimic以及报告基因表达载体共同转染入HEK293T细胞中,检测荧光素酶活性。5)MRNA表达谱芯片检测IDH1R132H及VECTOR的差异性基因,通过生物信息学分析IGF1R相关基因的变化。3.3验证IDH1R132H通过IGF1R促进良性前列腺上皮细胞RWPE-1恶性转化。1)Western Blot检测IGF 1R下游信号通路AKT,STAT3及磷酸化活性形式的变化。2)siRNA干扰IGF1R后检测AKT,STAT3以及其磷酸化活性形式的变化。3)siRNA干扰IGF1R,MTS及Transwell实验检测细胞增殖迁移能力的变化。研究结果:1、IDH1R132H在前列腺癌中的发生率为0.6%(2/336),IDH1R132H前列腺癌患者缺乏常见的基因突变表型1.1免疫组织化学(IHC)检测前列腺癌病例标本共计336例,结果显示IDH1R132H表达强阳性(2+,3+)的病例有4个,IDH1R132H表达弱阳性(1+)的病例有11个。IDH1R13H主要表达于前列腺癌组织的细胞浆和细胞核中。1.2通过PCR基础上的测序证实IDH1R132H的发生率为0.6%(2/336)。免疫组化结果显示其他重要的前列腺癌相关的分子特征性改变如ERG重排,SPINK1过表达等均为阴性。1.3通过PCR基础上的测序结果显示,前列腺癌细胞系LNCAP,VCAP,22RV1以及良性前列腺上皮细胞RWPE-1中均未发现IDH1R132H突变。2、IDH1R132H促进良性前列腺上皮细胞RWPE-1恶性转化2.1 IDH1R132H促进RWPE-1细胞株细胞因子的非依赖性生长,促进RWPE-1细胞迁移。2.2 IDH1R132H抑制LNCAP细胞的增殖和迁移能力。2.3 IDH1R132H促进干细胞指标CD133的表达。2.4 AGI5198抑制IDH1R132H突变的RWPE-1细胞增殖及迁移能力。3、IDH1R132H 通过改变组蛋白修饰抑制 miR-141-3p,miR-223-3p,miR-7-5p 的表达,使IGF1R的表达水平增高,激活AKT/STAT3信号通路,从而促进RWPE-1细胞恶性转化3.1 IDH1R132H 调控 microRNA 的表达。1)MicroRNA芯片显示,将IDH1R132H/VECTOR差异两倍以上的microRNA和IDH1R132H/IDH1WT差异两倍以上的microRNA取交集。IDH1R132H中共同上调的microRNA有4个,共同下调的microRNA有68个。2)通过查找文献,在IDH1R132H下调的microRNA中筛选前列腺癌中具有抑癌功能的 microRNA,进行 PCR 验证其表达,其中 miR-141-3p,miR-223-3p,miR-7-5p下调倍数最明显。3)ChIP实验证明,在miR-141启动子区上游P3、P4,miR-7-1的P2、P4,以及miR-223的P2、P3、P4引物扩增位置有H3K4me3富集的降低,此外在miR-7-1的P2以及miR-223的P2位置,有H3K27me3的富集升高。3.2 IDH1R132H 通过抑制 miR-141-3p,miR-7-5p,miR-223-3p 的表达从而使IGF1R的表达水平升高。1)Targetscan 预测发现 IGF1R 为 miR-141-3p,miR-7-5p,miR-223-3p 的共同靶基因。2)IDH1R132H促进RWPE-1细胞中IGF1R的蛋白表达。3)稳定表达IDH1R132H的RWPE-1细胞加入microRNA的mimics后IGF1R的蛋白水平表达降低。4)双荧光素酶实验证实IGF1R为miR-141-3p,miR-7-5p,miR-223-3p的靶基因。5)GSEA分析显示IGF1R所上调的基因富集在IDH1R132H中。3.3 IDH1R132H通过上调IGF1R使RWPE-1细胞恶性转化。1)IDH1R132H促进IGF1R下游AKT,STAT3信号通路激活。2)表达 IDH1R132H 的 RWPE-1 细胞中,干扰 IGF1R 后 P-AKT,P-STAT3 的表达水平降低。3)干扰IGF1R后,表达IDH1R132H的RWPE-1细胞增殖能力以及迁移能力均被抑制。研究结论:1、IDH1R132H在前列腺癌病人中的发生率为0.6%(2/336),IDH1突变阳性的前列腺癌病例缺乏其他前列腺癌重要的分子病理特征改变。2、IDH1R132H可以促进良性前列腺上皮细胞发生恶性转化—细胞因子的非依赖性生长,迁移能力增强。3、IDH1R132H 通过抑制 miR-141-3p,miR-7-5p,miR-223-3p 的表达,促使 IGF1R—AKT/STAT3信号通路的激活从而促进良性前列腺上皮细胞恶性转化。