【摘 要】
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磁性微球是一种新型多功能材料,因其兼具高分子微球特性与超顺磁性,被广泛应用于蛋白质分子纯化、固定化酶、核酸提取、细胞分离及免疫分析等领域。然而,在实际样品分离过程中,许多不需要的化合物被吸附在微球的表面上,影响分离提取的纯度。在免疫检测过程中,会对其他生物分子产生非特异性结合,造成假阳性,或者由于灵敏度低而需要进行样品稀释,增加检测步骤繁琐程度。因此,本文对磁性微球表面进行了不同种类高分子以及生物
【基金项目】
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国家重点研发计划课题(2017YFA0205502)
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磁性微球是一种新型多功能材料,因其兼具高分子微球特性与超顺磁性,被广泛应用于蛋白质分子纯化、固定化酶、核酸提取、细胞分离及免疫分析等领域。然而,在实际样品分离过程中,许多不需要的化合物被吸附在微球的表面上,影响分离提取的纯度。在免疫检测过程中,会对其他生物分子产生非特异性结合,造成假阳性,或者由于灵敏度低而需要进行样品稀释,增加检测步骤繁琐程度。因此,本文对磁性微球表面进行了不同种类高分子以及生物分子修饰,并用化学发光免疫检测对磁性微球进行评价,为磁性微球在生物提取、免疫检测等应用领域提供参考。首先,本文先选择不同分子量的PAA(聚丙烯酸)与葡聚糖对氨基磁性微球进行表面羧基改性,筛选出PAA 5000为最优修饰分子。以此为基础,在磁性微球表面修饰PEG(聚乙二醇)分子,修饰之后,抗体结合量升高,化学发光检测本底值降低,灵敏度提升。然后,对PAA与PEG修饰磁性微球的偶联抗体条件进行优化。非特异性吸附检测结果显示,PEG修饰确实能够降低磁性微球表面的非特异性吸附。最后,稳定性实验显示高分子修饰磁性微球和抗体磁性微球分别在3个月和45天内维持各种性质稳定。因此,PAA与PEG这两种高分子修饰能够有效提升磁性微球的分散稳定性、免疫检测灵敏度,为磁性微球表面高分子修饰提供参考。随后,本文先以PAA修饰的羧基磁性微球为基础,分别使用先吸附再交联法(一步法)、先活化再偶联法(两步法)进行表面亲和素交联。筛选出两种方法中最优的反应条件,一步法每毫克磁性微球可偶联95μg的SA(链霉亲和素),两步法每毫克磁性微球可偶联23.8μg的SA。推测出两种方法形成的SA磁性微球的不同结构:一步法-多层吸附、两步法-单层吸附。然后,对PEG修饰的磁性微球进行SA偶联,发现其在两步法上可以降低SA磁性微球的非特异性吸附。最后,SA磁性微球在20周内能够维持良好的稳定性以及免疫检测的灵敏度,不失为一种良好的生物分子功能化磁性微球。最后,本文选用PAA修饰的羧基磁性微球为对照,比较链霉亲和素磁性微球和蛋白A磁性微球在抗体偶联上的效果。SA磁性微球抗体偶联率在80%以上,蛋白A磁性微球在39%以上,二者抗体偶联率均高于羧基磁性微球(33%)。之后,选择抗体偶联量相同的三种磁性微球进行比较,检测灵敏度上SA磁性微球>蛋白A磁性微球>羧基磁性微球,抗非特异性吸附效果上SA磁性微球>羧基磁性微球>蛋白A磁性微球。因此,SA磁性微球和蛋白A磁性微球,相比于羧基磁性微球在偶联抗体上显示出更高的偶联率、抗体活性及免疫检测灵敏度,为抗体磁性微球的制备提供了一种新的参考思路。
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