前言世界卫生组织2008年公布,全球每年至少有280万的成年人死于肥胖或者超重以及包括心脑血管疾病、糖尿病、癌症等与肥胖有着密切不可分割关系的全身系统性疾病。而慢性牙周炎,是口腔致病菌为主导的,病因复杂的以牙周支持组织破坏为特征的慢性炎症性疾病,是导致我国成年人失牙的首要因素。已经有相对明确的证据证实,全身系统性疾病诸如代谢综合征、糖尿病、心血管疾病、风湿性关节炎会导致牙周组织发生更加严重、迅速的破坏,而越来越多的研究显示,控制不良的牙周炎——这一局部炎症因素,也可能导致全身系统性疾病的不良发展,进而引发临床医师以及科研工作者的重视。脂肪组织由大量疏松脂肪细胞以及薄层结缔组织构成,其中薄层结缔组织主要由血管基质细胞(vascular stromal cell, VSC)、神经细胞、巨噬细胞等构成,将体积相对庞大的脂肪组织分割成众多小叶。对于脂肪组织的研究日益深入,其不仅是能量的储存库,还是活跃的内分泌器官。以往大部分的研究多致力于脂肪细胞,而最近对于非脂肪组织的研究指出,非脂肪组织尤其是其中的巨噬细胞在肥胖机体的炎症因子分泌以及炎症状态可能起着重要的影响作用。Hotamisligil等于1993年的研究首次指出了肥胖者脂肪组织中炎症因子TNF-α表达上升,从而首次将肥胖与炎症联系起来。而后越来越多的研究指出,脂肪组织可以分泌包括TNF-α, IL-1β, CRP等在内的多种炎症因子,相关炎症因子可以进入血液循环,从而使得肥胖者全身呈现出一种慢性低度的病理性炎症状态,这本身与糖尿病、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、心血管疾病及代谢综合征等疾病的病理生理学机制相似,使得炎症成为连结众多全身系统疾病的重要纽带。胰岛素抵抗(Insulin Resistance, IR)是Ⅱ型糖尿病(Type II Diabetes Mellitus, T2DM)的特征,是指单位浓度的胰岛素细胞效应减弱,既胰岛素对组织(主要是肝脏、肌肉和脂肪)的作用减弱,此时,胰岛β细胞通过分泌增多的胰岛素以维持正常的糖代谢。肿瘤坏死因子-a (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)是机体重要的炎症因子,在包括心血管疾病、Ⅱ型糖尿病、风湿性关节炎等系统性疾病的发生发展中起重要的作用。TNF-α、IL-1β可通过介导胰岛β细胞破坏而导致胰岛素抵抗,导致糖尿病以及其相关并发症的发生、发展,而研究也指出,使用相关炎症因子的拮抗剂以及抗体可在T2DM的治疗中起一定效果。TNF-α和IL-1β在牙周炎的牙周组织破坏中起重要作用。牙周炎症部位龈沟液中的TNF-α和IL-1β浓度高于健康对照部位,其升高程度与牙周支持组织的破坏以及预后有密切关系,而治疗后相关炎症因子在局部浓度下降,表现为临床症状的缓解。IL-1β和TNF-α的拮抗剂可使局部IL-1β和TNF-α等炎症因子的表达水平下降,为牙周炎的治疗提供了依据。牙周炎与肥胖有关,且牙周炎的不良进展与体重指数(Body Mass Index,简称BMI)的增加、糖尿病患者的糖化血红蛋白控制不良、较高空腹血糖有关,并可能影响牙周炎的治疗效果,以及更加严重的牙槽骨丧失。牙周炎与全身疾病相关性的研究指出,局部过高表达的炎症因子可能会影响全身系统性疾病以及其并发症的发生发展。本实验通过建立牙周炎复合糖尿病大鼠模型,检测各组大鼠模型中局部牙龈组织以及血清中的TNF-α及IL-1β表达的差异及其与胰岛素抵抗的关系,初步探讨牙周局部因素影响大鼠全身炎症状态的可能机制。第一章牙周炎复合肥胖大鼠模型的建立目的：建立牙周炎复合肥胖大鼠模型,为研究牙周炎与肥胖性胰岛素抵抗的关系奠定模型基础。方法：(1)取雄性大鼠32只,随机平均分为健康对照组(C)、肥胖组(0B)、牙周炎组(CP)、牙周炎复合肥胖组(CP+OB)四组,每组各8只；(2)健康对照组(C)：不施加任何干预措施；(3)牙周炎组(CP)：麻醉状态下,于12周龄时,10%水合氯醛(0.3ml/100g·bw),腹腔内注射麻醉下,分别结扎大鼠的左、右上颌第一磨牙及第二磨牙(3-0丝线,泰丝),结扎丝置于龈沟内,涂布4种牙周主要致病菌的标准株混合悬液：牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg) ATCC33277,伴放线嗜血杆菌(Hctinobacillus actinomycetemcomitans, Ha) ATCC29523,中间普氏菌(Prevotella intermedia, Pi) ATCC25611,具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum, Fn) ATCC25586于龈沟内,109CFU/mL.普通饲料饲养；每日观察大鼠日常状态并记录；观察结扎丝状态,若出现松脱,及时重新结扎,建模时间约8周,既约于大鼠20周龄时成模；(4)肥胖组(0B)：分别于出生后2、4、6、8、10天皮下注射谷氨酸钠(monosodium glutamate, MSG),3mg/g. bw,建立肥胖大鼠模型；(5)复合组(CP+OB):肥胖建模处理同0B组,12周时肥胖成模后给予CP组处理方法,约20周龄时成模;(6)待大鼠20周龄时,处死,采集大鼠血清,取局部牙龈组织样本,行相关检测：1)牙周炎模型相关指标检测：大体观察牙龈组织局部炎症的临床表现,组织块切片,苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE staining),显微镜下观察结果,Micro-CT检测牙槽骨丧失情况；2)肥胖模型相关指标检测：测量大鼠体重、体长,计算Lee’s指数,检测空腹葡萄糖值、空腹胰岛素值,计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);3)牙周炎复合肥胖模型指标检测：牙周炎相关指标检测同牙周炎模型,检测是否成功建立牙周炎模型,肥胖相关指标检测同肥胖模型,检测是否成功建立肥胖模型,综合上述二者。结果：1)牙周炎模型指标：结扎后的患牙,可见以下特征①口内检查可见结扎后的患牙,结扎丝存,丝线上偶见食物残留,结扎患牙局部牙龈暗红色,稍肿胀,牙龈乳头质地松软,糜烂,可见不同程度的牙龈退缩,牙根暴露；②组织学结果(HE染色)：可见牙周袋底炎症细胞浸润,牙槽骨吸收；③Micro-CT结果可示：大鼠牙周骨组织明显的牙槽骨线性丧失以及牙槽骨体积丧失。CP+OB组相比于0B组,CP组相比于C组,前者均示显著的上述三个牙周炎症的特征,表现为更明显的牙周组织炎症,表明大鼠牙周炎模型建立成功；2)肥胖模型指标：MSG处理过的大鼠,呈现向心性肥胖、体重增加、Lee’s指数升高,空腹血糖值、空腹胰岛素值以及胰岛素抵抗指数升高,其中,0B组以及CP+OB组上述特征显著,提示肥胖大鼠模型建模成功；3)牙周炎复合肥胖组模型指标：CP+OB组可见肥胖以及牙周炎两种处理因素处理过的大鼠模型的特征。结论：采用于大鼠新生期皮下注射谷氨酸钠可建立肥胖大鼠模型,建模时间约8周；牙周结扎以及涂布四种牙周致病菌可以建立牙周炎大鼠模型,建模时间约12周；而于大鼠新生期予以肥胖处理并于12周予牙周炎处理,可成功建立牙周炎复合肥胖的大鼠模型；建模成功为研究牙周炎与肥胖性胰岛素抵抗的关系奠定模型基础。第二章牙周炎复合肥胖大鼠血清炎症因子表达及与胰岛素抵抗之间的关系目的：通过比较牙周炎复合肥胖组大鼠模型中血清炎症因子TNF-α以及IL-1β表达,了解牙周炎局部刺激因素对肥胖机体全身炎症状态的可能影响机制,并分析其与全身胰岛素抵抗之间的可能关系。方法：大鼠处死后,取各组血清,用免疫酶联吸附反应(ELISA)法检测血清TNF-α及IL-1β水平,根据大鼠空腹血糖值以及空腹胰岛素值计算胰岛素抵抗指数,行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示,应用SPSS(?)v13.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析。先对各指标行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2×2析因设计,分析两种干预主效应及交互作用,再用t检验进行两两比较。相关分析采用Pearson相关。当P<0.05时,被认为差异具有统计学意义。r为正表示正相关,为负表示为负相关,为零既为无相关。结果：血清TNF-α及IL-1β的ELISA检测结果显示,与C组相比,CP组(t=2.449,P=0.028)以及0B组(t=5.680,P=0.000)的TNF-α表达水平显著升高,CP组(t=3.417,P=0.028)以及0B组(t=2.790,P=0.000)的IL-1β表达水平亦显著升高；与OB组相比,OB+CP组TNF-α(t=10.049, P=0.000)及IL-1β(t=11.577, P=0.000)表达水平显著上升；OB+CP与CP组相比,TNF-α(t=9.873, P=0.000)及IL-1β(t=10.142, P=0.000)表达水平亦显著升高。牙周炎与肥胖两处理因素对机体血清TNF-α及IL-1β水平的升高具有协同交互作用(F=28.061, P=0.000). HOMA-IR评分显示,OB+CP组>OB组>CP组>C组,相关性分析显示,血清TNF-α(r=0.854)及IL-1β(r=0.730)水平与胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)呈正相关。结论：肥胖以及牙周炎均可以升高机体血清的炎症因子表达,肥胖以及牙周炎处理因素对机体炎症因子TNF-α及IL-1β的升高有协同因素,而血清TNF-α及IL-1β的升高与胰岛素抵抗指数正相关。第三章牙周炎复合肥胖大鼠牙龈组织中炎症因子表达研究目的：通过检测牙周炎复合肥胖大鼠模型牙龈组织中炎症因子TNF-α及IL-1β的表达改变,初步分析肥胖机体对牙周组织局部炎症的特应性。方法：处死模型动物后,近远中向获取四组大鼠的牙龈组织,经由福尔马林固定,采用免疫组化Envision二步法对切片染色,检测牙龈组织中的TNF-α以及IL-1β的蛋白表达水平。各实验组分别与PBS代替一抗空白对照进行对比观察,并用Image-Pro Plus6.0进行图像采集。计算光密度值。应用SPSSv13.0软件(SPSS Inc., Chicago, USA)进行统计分析,实验数据以均数±标准差来表示。先对各指标行正态性及方差齐性检验。两因素两水平数据比较采用2×2析因设计,分析两种干预主效应及交互作用,再用t检验进行两两比较。结果：牙龈组织中TNF-α及IL-1β免疫组化染色显示,CP以及OB+CP组成纤维细胞、上皮内纤维化组织、少量上皮内可见阳性表达的棕色颗粒。平均光密度值结果表明,CP组TNF-α (P=0.000)及IL-1β(P=0.002)表达显著高于C组,而0B组TNF-α (P=0.078)以及IL-1β (P=0.467)表达较C组低,但没有统计学意义,OB+CP组TNF-α表达显著低于CP组(P=0.000), OB+CP组IL-1β表达显著低于CP组(P=0.000)。结论：牙周炎可以促进局部牙周组织的炎症因子TNF-α及IL-1β的表达水平升高,但在肥胖机体状态下,可能由于机体局部固有免疫系统受损或者耐受而使得局部炎症反应水平有一定的下降,致使牙周局部组织对外界刺激的抵抗力降低。