慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）是一类危害人类健康的常见疾病,其病程呈进行性、不可逆性发展,最终导致终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）。KDIGO对CKD提出了统一的定义和分期后,全球范围内有多个国家对CKD先后开展了大规模的流行病学研究。据报道,2017年全球CKD患病人数近7亿人,患病率约9.1%,有123万例死于CKD。我国成年人群CKD总患病率约为10.8%,在2017年CKD患者人数约1.35亿,死亡人数达到19万。CKD严重影响了患者的生活质量,给患者及其家庭带来了沉重的精神压力和经济负担,同时也消耗了全球巨大的社会医疗资源。随着人们生活水平的提高,饮食方式的改变,人口老龄化趋势,感染及日常生活中药物不合理使用等原因,全球范围内CKD发病率将以每年8%的比例逐年增长,估计到2040年CKD将居人类致死病因的第5位。因此,如何科学有效地防治CKD是全球亟需解决的重要问题。大量研究结果表明,CKD患者早期临床症状往往并不明显,未能够及时诊断并接受早期药物的干预治疗,以至于多数患者出现了明显的临床症状,甚至是肾功能严重受损后才被临床诊断,失去了最佳的治疗时机。因此,近年来国际肾脏病学界共同关注的重点是对CKD早期患者进行筛查、诊断、干预、防治及监测,控制高危人群的危险因素,以延缓肾脏功能的进展性恶化,最终减少心血管合并症和CKD患者总体的病死率。但目前的诊断方法,如血清肌酐（serum creatinine,s Cr）、肾脏活检病理检查、尿蛋白检测等,尚不能完全满足临床需求。因此,寻找一种能够动态的、客观的、高敏感性的、非创伤或低创伤的诊断方法用于肾脏病的早期诊断具有重要的临床意义和科学价值。微小RNA（micro RNA,mi RNA）是广泛存在于动植物体内的一类内源性非编码单链RNA,一般通过作用于靶基因3′非编码区（untranslated region,UTR）,降解靶基因m RNAs或者抑制其翻译过程,实现对基因转录后水平的调控,在细胞增殖、分化、凋亡、代谢等方面发挥重要的生理学功能。研究发现,mi RNAs可广泛而稳定地存在于血清、血浆、尿液、唾液等各类体液中,被统称为循环mi RNAs。由于血清或尿液中mi RNAs的获取具有无创伤或低创伤性,且表达稳定、存储方便,故常被作为新型的生物标志物用于多种疾病的诊断和判断预后。有研究证实尿液中的mi RNAs可用于一些肾脏病的诊断,而血清中mi RNAs在CKD诊断中的作用,相关的文献报道非常有限。如果血清mi RNA作为生物标志物,必须准确测定其表达水平。目前,血清mi RNA的定量方法主要包括实时定量PCR（quantitative real-time transcription PCR,q RT-PCR）和基因芯片（c DNA chip）,这些方法固然具有自身的优势,但也存在一些不足。随着高通量测序技术快速发展,出现了新一代的测序方法（next-generation sequencing,NGS）,即转录组测序（RNA sequencing,RNA-seq）,能一次平行对几十万到几百万条DNA分子进行测序,具有检测范围广、通量高、准确度高、灵敏度高、重复性好、分析可靠、所需起始样品少等特点,而且无需预先设计探针,能发现新的转录本、剪切变异体等,再加上近些年来高通量大规模测序平台陆续开发,使得测序流程更加简化,成本明显降低,因此,RNA-seq成为了一个强有力的工具,广泛应用于临床上多种疾病相关基因的检测和科学研究。目的:通过RNA-seq方法筛选CKD1期和CKD5期患者血清中差异表达的mi RNAs,作为CKD发生发展的生物标志物。方法:1.收集血清样本:收集因原发性肾小球肾炎导致的CKD1期和CKD5期患者以及健康对照组人群的血清样本,其中CKD1期患者15例、CKD5期患者30例和健康对照人群15例;把每组内5个血清样本等体积预混用于后续测序研究。2.RNA-seq筛选差异表达的mi RNAs:提取预混后每组血清样本总RNA,测定其纯度和浓度,构建mi RNA测序文库,测序并进行数据分析。本研究差异表达mi RNAs的筛选标准为:差异倍数≥2.0、P<0.05,且mi RNA的平均读值≥50;根据差异表达的mi RNAs绘制mi RNA聚类分析热图。3.生物信息学分析:根据Targetscan和mirdb V5数据库预测差异表达mi RNA的靶基因,并以2个数据库共同预测的靶基因作为进一步分析的依据;使用top GO对top10差异表达mi RNAs的靶基因进行GO分析;对差异表达mi RNAs的靶基因进行KEGG通路分析;选取Genecards数据库,以“kidney diseases”作为关键词,检索目前已知与肾脏病相关的基因,并以此作为mi RNAs靶基因与肾脏病相关性分析的依据。4.q RT-PCR验证差异表达的mi RNA:分别收集25例CKD1期患者、40例CKD5期患者和20例健康对照人群的血清样本,提取RNA、反转录、q RT-PCR反应和统计学分析。结果:1.本研究入组人群的基本信息:本研究共有145例参与者,其中在RNA-seq筛选阶段,有60例,包括15例CKD1期患者（男9例、女6例,平均年龄51.40±10.12）,30例CKD5期患者（男18例、女12例,平均年龄53.80±12.75）,15例健康对照组人群（男9例、女6例,平均年龄52.40±7.75）;在q RT-PCR验证阶段,有85例参与者,其中25例CKD1期患者（男16例、女9例,平均年龄51.16±9.75）,40例CKD5期患者（男25例、女15例,平均年龄50.70±14.75）,20例健康对照组人群（男12例、女8例,平均年龄49.39±11.10）。2.RNA-seq筛选差异表达的mi RNAs:根据筛选标准,三个组别进行两两比较后,一共筛选得到98个差异表达的mi RNAs,并按照组别分别进行了韦恩图（Venn diagram）分析和聚类分析。与健康对照组相比较,CKD1组筛选出20个差异表达mi RNAs,其中9个上调,11个下调;CKD5组筛选出42个差异表达mi RNAs,其中5个上调,37个下调。与CKD1组相比较,CKD5组筛选出70个差异表达mi RNAs,其中14个上调,56个下调。韦恩图结果显示,在两两比较的差异表达mi RNAs中,有32个mi RNAs在结果中出现了2次,只有1个mi RNA,即mi R-483-5p在结果中出现了3次,提示其可能在CKD发生发展中具有重要的意义。3.差异表达mi RNAs靶基因的预测:98个差异表达mi RNAs预测出5200多个靶基因,其中有的mi RNAs预测可以调控多种靶基因,而有的基因又可以被多种mi RNAs所调控。4.差异表达mi RNAs的靶基因GO分析:根据差异表达mi RNAs预测的靶基因,我们从生物过程（biological process,BP）、细胞组分（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）3个方面对靶基因进行了GO富集分析。在不同组别的生物过程条目中发现,预测的靶基因参与了多种形式的代谢过程等。而在不同组别的分子功能条目中发现,预测的靶基因参与了不同形式的转录调控等。5.差异表达mi RNAs的靶基因KEGG分析:根据KEGG分析得分,列举出不同组别top 10 KEGG信号通路。结果发现,预测的靶基因参与了多种代谢通路;此外,转化生长因子-β（TGF-β）、自噬（autophagy）、AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（m TOR）、叉头转录因子（Fox O）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等信号通路也参与其中。6.部分差异表达mi RNAs进行q RT-PCR验证:根据测序结果和相关文献报道,我们选取了mi R-483-5p和mi R-363-3p在临床样本中通过q RT-PCR方法做了进一步验证。结果发现,相比于健康对照组,mi R-483-5p在CKD1组和CKD5组中表达均上调,差异倍数分别为2.56倍（P<0.01）和18.77倍（P<0.01）;mi R-363-3p在CKD5组中低表达,表达量分别是健康对照组和CKD1组的0.27倍（P<0.05）、0.48倍（P<0.05）。mi R-483-5p和mi R-363-3p的q RT-PCR结果与测序结果相似,提示可作为CKD早期诊断和病程评估的血清标志物。7.预测mi R-483-5p和mi R-363-3p靶基因中与肾脏病相关的基因:结果显示,mi R-483-5p有7个靶基因,mi R-363-3p有160个靶基因与肾脏病相关。结论:1.本研究采用RNA-seq方法筛选出CKD1期、CKD5期患者和健康对照组血清中差异表达的mi RNAs,可作为后期进一步筛选CKD血清标志物的基础研究。2.生物信息学分析发现,差异表达mi RNAs所预测的靶基因参与了多种形式的代谢过程和转录调控,也参与了与肾脏病发生相关的信号通路。3.RNA-seq和q RT-PCR结果均发现,mi R-483-5p在CKD1期和CKD5期患者血清中高表达,mi R-363-3p在CKD5期患者血清中低表达,两者有望作为CKD早期诊断和病程评估的生物标志物。