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背景心房颤动(Atrial Fibrillation,AF)是心血管疾病中最常见的心律失常,也是链球菌感染所致瓣膜损害引起的风湿性心脏病(Rheumatic Heart Disease,RHD)最常见的临床表现。RHD伴AF患者心房纤维化是由心肌成纤维细胞增殖所致,是AF患者心房结构重构的主要表现,其过程不可逆。在纤维化心肌组织中存在转化生长因子(Transforming Growth Factor,TGF)-β1高表达。促进胶原沉积以外,TGF-β1还可促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化。尽管基质金属蛋白酶抑制因子(Tissue inhibitor metalloproteinase,TIMP)家族的四个成员结构相似,但其表达模式存在明显差异。研究显示,TIMP-4参与控制常态下ECM的降解过程,其过表达会导致与纤维化及炎症相关的信号通路激活。但是,目前对于二者之间相互作用及其对心肌纤维化的调控作用尚不清楚,尤其是缺乏TIMP-4与心肌纤维化关联的研究数据。本研究共分为两部分。第一部分采用Masson染色、Western Blot技术等方法,检测和比较RHD窦性心律(Sinus rhythm,SR)和AF患者心房组织中心肌纤维化标志物MMP-2、胶原I和胶原Ⅲ蛋白表达水平,同时检测TIMP-4、TGF-β1的蛋白表达水平,以明确TIMP-4、TGF-β1与心肌纤维化的关联与分泌特征;同时,对心房组织中TIMP-4的蛋白表达特征进行观察和分析,分析TIMP-4与心房纤维化程度的相关性。第二部分采用实时荧光定量RT-PCR检测等技术分析研究RHD房颤心房组织中TIMP-4/TGF-β1m RNA表达水平,验证和分析TIMP-4/TGF-β1介导心房纤维化的相互作用;观察TGF-β1不同刺激时间长度对TIMP-4蛋白表达的影响,判断TGF-β1抑制TIMP-4表达是否具有时间依赖性,以进一步评估TIMP-4与TGF-β1介导心肌纤维化的调控作用。目的l检测心房组织中心肌纤维化标志物MMP-2、胶原I和胶原Ⅲ蛋白表达水平,进一步确定TIMP-4、TGF-β1与心肌纤维化的关联;同时,对RHD房颤心房组织中TIMP-4的蛋白表达特征进行分析,以明确TIMP-4与心房纤维化程度的相关性;l检测TGF-β1在心肌纤维化组织中的蛋白表达水平和分泌特征,进一步分析TGF-β1对TIMP-4蛋白表达的影响;l研究RHD房颤心房组织中TIMP-4/TGF-β1m RNA协同表达水平,验证和分析TIMP-4/TGF-β1二者介导心房纤维化的相互作用;l研究TGF-β1不同刺激时间长度对TIMP-4蛋白表达的影响,判断TGF-β1的抑制心脏成纤维细胞TIMP-4表达是否具有时间依赖性,以进一步评估TIMP-4与TGF-β1介导心肌纤维化的调控作用。方法1.采用系统抽样法随机选取接受换瓣手术和心导管检查的RHD患者53例,根据患者术前的心律特征分为2组:窦性心律(SR)组26例和慢性心房颤动(AF持续时间大于6个月)(AF)组27例;2.于手术时获取右心耳组织,Masson染色检测两组心房组织心肌纤维化程度。计算胶原面积使用了IPP(Image pro plus)7.0图像分析软件;每张切片高倍视野下随机选取10个视野,来测定胶原总面积。用图像总面积除以胶原总面积并取平均值,确定胶原容积分数(Collagen Volumefraction,CVF);3.Western Blot检测心房组织中TGF-β1、MMP-2、TIMP-4和胶原I、Ⅲ的蛋白表达情况。提取各实验孔细胞蛋白在干预后的不同时间点,在各时间梯度采用Western Blot法检测心肌成纤维细胞TIMP-4蛋白表达情况,判断TGF-β1对其影响。重复培养3个批次的细胞,每个批次细胞重复试验3次;4.实时荧光定量RT-PCR检测心房组织中TGF-β1和TIMP-4的m RNA表达情况。体外培养患者成纤维细胞,分别在0 h,12 h,24 h,48 h和72 h,用人重组TGF-β1(100 ng/ml)作用于成纤维细胞,检测TGF-β1在不同时间梯度刺激下心肌成纤维细胞TIMP-4蛋白的表达情况;5.统计学处理:数据统计分析使用SPSS19.0软件。采用均数±标准差(±s)表示计量资料数据,采用两独立样本t检验进行组间比较,采用Pearson分析方法进行相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1.AF组患者的左心房直径(Left Atrial Diameter,LAD)较SR组明显扩大(57.6±10.2 VS.44.3±4.8,P<0.01)。CVF在AF组心肌显著高于SR组,两者差异具有统计学意义(P<0.05);2.心肌纤维化标志物MMP-2、胶原I和胶原Ⅲ蛋白表达水平在AF组均显著高于SR组,两者差异具有统计学意义(均P<0.05);3.心房组织TIMP-4蛋白及m RNA表达水平在AF组均显著低于SR组(均P<0.05),而TGF-β1的蛋白及m RNA表达水平均显著升高(均P<0.05),TIMP-4表达水平与TGF-β1表达水平呈明显负相关(r=-0.98,P<0.01);4.心脏成纤维细胞TIMP-4表达被TGF-β1抑制并呈时间依赖性。结论1.风心病AF患者心房组织中TIMP-4与心房间质纤维化关系密切,其蛋白表达下调;2.TGF-β1显著抑制心脏成纤维细胞TIMP-4的表达并呈时间依赖性;3.心房中TIMP-4表达的降低及TGF-β1表达的增加与心房纤维化及心房中ECM变化具有相关性;4.研究结果支持“TIMP-4及TGF-β1参与RHD患者AF发病”的假设,并提示TGF-β1、TIMP-4及ECM分子可被用作RHD患者AF发生的生物标志物。