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马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是烟草生产中危害严重的三种病毒,严重影响植物生长,造成重大的经济损失,培育抗病型品种势在必行。RNA介导的病毒抗性是近年来发展起来的一种有效防治植物病毒病害的策略,具有抗性持久、抗病程度高、生物安全性高等优点,为植物抗病毒策略提供了新的途径。本实验以马铃薯Y病毒(PVY)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV)的衣壳蛋白(coat protein,CP)基因、马铃薯Y病毒(PVY)的抑制子基因(HC-pro)、烟草花叶病毒(TMV)的抑制子基因(p126)和黄瓜花叶病毒(CMV)的抑制子基因(2b)为靶序列,构建了不同病毒基因排列顺序的嵌合基因发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体,通过电激法导入农杆菌LBA4404,采用叶盘法转化烟草NC89。对获得的转基因烟草进行抗性鉴定,比较不同病毒基因排列顺序的嵌合基因对RNA介导的病毒抗性的影响,为培育多抗病毒的转基因植株提供依据。研究获得的主要结果和结论如下:(1)根据已克隆出的CMV CP基因和2b基因、PVY CP基因和HC-pro基因、TMV CP基因和p126基因的全序列,设计并合成引物,通过PCR扩增获得长度为300bp的cDNA的片段,按不同排列顺序拼接成嵌合基因,进而分别反向重复插入双元载体pROKⅡ中,构建不同病毒基因排列顺序的嵌合基因发夹RNA(hairpin RNA,hpRNA)结构的植物表达载体pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC。(2)将构建好的植物表达载体pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC通过电激法导入农杆菌LBA4404中,采用叶盘法转化烟草NC89。经过卡那霉素的筛选和PCR的鉴定,最终获得转基因pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC的T0代植株102株、103株、116株、114株、105株、108株。(3)转基因植株的Southern杂交结果表明外源目的基因已成功地整合到了烟草基因组中。(4)转基因植株的Northern杂交结果表明转基因在RNA水平上都得到了表达,接毒感病的转基因烟草中总RNA的积累量明显高于接毒抗病的转基因烟草,也就是说目的基因的RNA的积累量与抗性能力呈现负相关,由此也证明转基因植株产生的病毒抗性是RNA介导产生的病毒抗性。(5)转基因植株的目的序列的siRNA的Northern杂交分析证明初级RNA在体内进行了表达,次级RNA在转录翻译的同时发生了信号的传递,向目的基因的上游和下游方向延伸,荧光定量PCR结果表明不同基因排列顺序的转基因植株的总RNA的表达量不同。