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炎症是机体活组织对各种致炎因素的一种正常防御反应,而过度的炎症反应会诱发众多疾病的发生,抗炎药物的应用在于抑制炎症反应的过度发生。非甾体抗炎药是目前针对炎症性疾病应用较为广泛的抗炎药物,但供患者选择的药物种类有限并存在个体差异,且长期大剂量使用容易引起胃肠道副作用。因此需要探索发现更多更为有效、副作用小的新型抗炎药物,从而为患者提供更多的用药选择,扩大临床用药范围。苯并噁唑类化合物是目前新药研发的重要领域之一,因其具有广泛的临床应用价值而备受关注,目前已有多种此类药物用于临床和科学研究。本实验室通过已建立的小分子筛选平台,筛选出4种具有生物活性的苯并噁唑类衍生物,其中发现K313具有显著的抗炎活性。目前尚未发现K313抗炎作用及机制研究的相关报道。因此,本课题将重点探索噁唑类化合物K313的抗炎特性及其作用机制,为发现新的抗炎药物奠定基础。目的通过建立炎症细胞模型,探讨噁唑类化合物K313的抗炎作用,以期发现新的具有显著抗炎活性的先导化合物;通过初步探讨K313的抗炎作用机制,揭示K313参与的抗炎信号通路以及可能作用的靶点,为抗炎药物靶点的选择提供新思路。方法第一部分建立和优化LPS诱导巨噬细胞炎性反应的细胞模型(1)采用CCK-8方法,检测并绘制RAW264.7巨噬细胞的生长曲线;(2)采用Griess reagent方法检测LPS诱导巨噬细胞产生的NO,确定LPS作用0-48 h的最适时间;确定LPS(0-1μg/ml)作用的最适浓度。第二部分K313抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生的炎性因子(1)采用Greiess Reagent方法检测活性小分子化合物(K296、K310、K313、K317)对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生NO情况;(2)采用CCK-8方法检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞有无毒性作用;(3)采用Greiess Reagent及3-硝基酪氨酸(3-NT)酶联免疫法检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生NO及3-NT的情况;(4)采用RT-PCR方法检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生的i NOS、IL-6和TNF-a炎性基因的情况;(5)采用ELISA方法检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生的IL-6和TNF-a炎性因子的情况。第三部分K313抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎性反应的机制研究(1)采用Western Blot方法检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞NF-κB、MAPKs(ERK1/2和p38 MAPK)、AKT炎性信号通路的作用;(2)采用Western Blot方法检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生GSK-3β信号蛋白的作用。结果第一部分建立和优化LPS诱导巨噬细胞炎性反应的细胞模型(1)观察不同接种密度的巨噬细胞的生长曲线,确定用于炎性药物筛选模型的接种密度为5×105个/m L;(2)通过检测LPS诱导RAW264.7巨噬细胞0-48 h产生的NO量,结果显示:刺激24 h产生的NO量迅速增高,在48 h达到平台期,确定用于炎症药物筛选模型的LPS刺激时间为24 h;(3)通过检测不同浓度LPS(0-1μg/m L)诱导RAW264.7巨噬细胞产生的NO量,结果显示:当浓度为100 ng/m L时,NO的产生达到平台期,确定用于炎症药物筛选模型的LPS浓度为100 ng/m L。第二部分K313抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生的炎性因子(1)通过检测4种具有生物活性的小分子化合物(K296、K310、K313、K317)对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生NO的作用,结果显示:与其它3种小分子化合物相比,K313更加显著地抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生NO,因此本研究采用K313进行抗炎作用及机制研究;(2)观察LPS及K313对RAW264.7巨噬细胞毒性作用,结果显示:K313(0-20μM)对RAW264.7巨噬细胞以及LPS诱导活化的RAW264.7巨噬细胞均无毒性作用,确定20μM K313作为后续实验的最高浓度;(3)检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎性基因的表达及炎性因子分泌影响,结果显示:K313(5、10、20μM)显著抑制i NOS、IL-6、TNF-α炎性基因的表达,NO、3-NT的产生及IL-6、TNF-α的分泌;(4)检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞COX-1和COX-2炎性基因的作用,结果显示:K313可显著抑制COX-2基因表达,但对COX-1表达无影响。第三部分K313抑制LPS诱导RAW264.7巨噬细胞产生炎性反应的机制研究(1)检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞的NF-κB信号通路的影响,结果显示:LPS可诱导p-p65、p-p38、p-ERK1/2和p-AKT蛋白在30 min表达最高,但K313对其表达均无影响作用,提示K313并非通过NF-κB、MAPKs、AKT信号通路发挥抗炎作用;(2)检测K313对LPS诱导RAW264.7巨噬细胞中p-GSK-3β(Ser9)和GSK-3β的蛋白表达影响,结果显示:K313可显著增强LPS诱导的GSK-3β(Ser9)蛋白磷酸化,提示K313是通过抑制GSK-3β活性介导抗炎作用。结论苯并噁唑化合物K313在LPS诱导的巨噬细胞炎性反应模型中,可显著抑制NO、IL-6、TNF-a分泌和COX-2表达;其作用机制可能是通过增加GSK-3β(Ser9)蛋白磷酸化,抑制GSK-3β蛋白活性,而抑制炎性细胞因子的产生,发挥抗炎作用。