第1章microRNA在肾透明细胞癌中的表达　　 肾癌是泌尿系常见的恶性肿瘤，发病率仅次于前列腺癌和膀胱癌居第三位，占全身恶性肿瘤的2-3％，死亡率超过40%。肾透明细胞癌(clear cell renal cellcarcinoma，CCRCC)是肾恶性肿瘤中最常见的类型，约占75%，发病机理尚不十分清楚，血管形成丰富为其特点，浸润和转移是其主要播散途径，大约40%的患者术后复发转移。转移性肾癌和手术后复发的肾癌，预后较差。肾癌的死亡原因主要是由于肿瘤的侵袭和转移。因此有必要对肾癌的发病机理进行深入的研究，为肾癌临床诊断和治疗提供依据。　　 microRNA简称miRNA，是新近发现的一类含有19～25个核苷酸不编码蛋白质的RNA，成熟的miRNA通过特异的识别其相应的靶基因，降解或抑制靶基因的mRNA的表达，调控细胞分化，增殖和调亡等。目前，越来越多的研究证实miRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要作用，而且miRNA表达情况可以预测肿瘤的恶性程度和肿瘤病人的预后。　　 为研究miRNA的在肾透明细胞癌中表达情况及其作用，我们应用miRNA基因芯片(包含人的723个成熟microRNA及76个病毒性microRNA, SangermiRBase10.1)，检测肾透明细胞癌中miRNA表达情况，筛选出在肿瘤组织中有明显表达改变的miRNA分子，运用Real-time PCR方法并结合临床资料进行进一步研究。miRNA基因芯片分析结果表明：在筛选条件Fold change>1.5，ANOVAp value<0.05的情况下，正常组织标本及各期肿瘤组织标本间，311个microRNA分子存在差异表达。38例样本聚类分析明显分成不同组别。与正常组织相比，hsa-miR-141，-200c在肿瘤组织中低表达：T1期肿瘤组织与远处转移肿瘤组织相比，hsa-miR-10b*在T1期肿瘤组织中高表达，在远处转移肿瘤组织中低表达。Real-time PCR实验进一步证实了基因芯片结果。microRNA分子hsa-miR-10b*在8例T3a期肿瘤组织中，4例呈高表达，与T1期肿瘤组织表达趋势一致，4例呈低表达，与远处转移肿瘤组织表达趋势一致。临床随访资料分析发现，4例hsa-miR-lOb*肿瘤组织高表达病人术后随访2～10年（平均6.7年），均未发现肿瘤远处转移；而4例hsa-miR-10b*肿瘤组织高表达病人中，2例治疗后已发生肿瘤远处转移，另外2例尚在肾切除术后1年内，仍未发现肿瘤转移，有待进一步临床观察随访。　　 由此我们得出结论：1．正常肾组织与肾透明细胞癌组织间，miRNA存在差异表达。2．T1期肿瘤同转移肿瘤间，miRNA存在差异表达。3．hsa-miR-10b*，-141，-200c可作为区分肿瘤与正常组织的潜在指标。4．hsa-miR10b*可作为区分T1期肿瘤与远处转移肿瘤的潜在指标，在预测肾肿瘤的恶性程度，转移趋势和肿瘤病人的预后方面具有一定研究价值。　　 第2章 RNAi载体pDsRed2-S1 lencerU6构建与表达　　 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年发现的调节基因表达的重要途径，在功能基因组研究、药物靶点认证和基因治疗等领域已经成为了重要的研究手段。质粒载体pSilencerU6含小鼠U6启动子，可以其开展基于RNAi技术的基因及蛋白功能研究。但其不含任何报告基团，难以在实验过程中对其进行实时监测。红色荧光蛋白DsRed2成熟快、低寡聚化，其发射波长较长，灵敏度与信噪比均比GFP高，可迅速在胞内表达，便于检测。为构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰质粒载体pDsRed2-SilencerU6，通过检测DsRed2的表达来监测RNA干扰质粒在细胞内的转染及表达便于开展RNA干扰研究，将质粒pDsRed2-N1中DsRed2蛋白的编码基因Bbs I酶切位点无意突变后，破坏pDsRed2-N1多克隆位点，PCR扩增CMV启动子、DsRed2蛋白基因片段并将其克隆至RNA干扰载体pSilencerU6，得到pDsRed2-SilencerU6质粒，利用脂质体转染技术将其转染HEK293T细胞，荧光显微镜、FACS检测效率。实验结果显示DsRed2蛋白编码基因序列Bbs I点突变正确，成功构建pDsRed2-SilencerU6载体，其在HEK293T细胞中可显著表达红色荧光蛋白，利用脂质体转染技术，转染效率达70.61%。本实验成功构建含红色荧光蛋白DsRed2的RNA干扰载体pDsRed2-SilencerU6并在哺乳动物细胞中表达，为今后开展RNA干扰研究提供了基础。