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目的:建立大鼠脑缺血再灌注模型并将体外合成HIF-1α质粒通过颈外-颈内动脉途径注射入大鼠脑组织中,应用透射电子显微镜观察大鼠脉络丛组织在脑缺血再灌注后6h、12h、24h、72h和7d时脉络丛内皮细胞的细胞器及细胞间连接的超微结构改变,以及外源性HIF-1α基因介导的细胞修复情况;探索外源性HIF-1α基因对脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法:1外合成的HIF-1α的cDNA,测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,克隆片段大小:2.5kb;酶切鉴定重组子,根据需要体外扩增。2鼠大脑中动脉脑缺血再灌注模型(MCAO)制作:采用250-280克雄性SD大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉,颈部正中切开,分离暴露颈总动脉分叉部,经颈外动脉向颈内动脉插入线栓,颈外动脉远端丝线结扎,线栓头端距血管分叉处1.8cm,线栓阻塞大脑中动脉。大鼠神经功能缺失评分按Zea Longa评分标准进行评分,MCAO模型建立2h后,选取Zea Longa评分为1-4分者为MCAO成功模型,2h后取出线栓并注入HIF-1α质粒,对照组注入PBS。3留取6h、12h、24h、72h和7d脑组织标本观察,将相应时间点实验组与对照组大鼠处死后断头取脑后,视交叉后做2mm厚连续切片,第一片做TTC染色,其余做石蜡包埋,5μm厚连续石蜡切片,行HE染色。4取相同时间点大鼠侧脑室脉络丛组织;低温下迅速取材以4%戊二醛浸泡固定2h(4℃),用0.1mol/L PBS洗涤,1%锇酸固定2h(室温),常规梯度乙醇及丙酮逐级脱水,环氧树脂618#包埋。用Reichert-Jung超薄切片机做0.5μm厚半薄切片,经1%甲苯胺蓝-天青Ⅱ染色,光镜下定位制备超薄切片(片厚50nm)。用醋酸双氧铀及枸橼酸铅染色,日立-7500透射电镜观察脑组织的超微形态学改变,了解侧脑室脉络丛的损伤变化情况。5统计学分析:使用SPSS15.0统计软件对实验数据进行统计学分析。组间计量资料比较采用t检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1构建HIF-1αcDNA,测序结果与Genebank记载完全一致(GenBank ID:3091),酶切鉴定后获得pcDNA3.1-HIF-1α质粒,克隆片段大小2.5kb。2大鼠神经功能缺失评分按Zea Longa评分标准进行评分,MCAO模型建立2h后,选取再灌注6h,12h,24h,72h,7d时间点进行观察,实验组与对照组在死亡率上无明显差别,神经功能缺失评分上实验组与对照组无明显差别。3在缺血再灌注早期(6h—24h)实验组与对照组在脑切片TTC染色梗塞面积无明显差别,再灌注72h以后可见实验组梗塞面积小于对照组。4 HIF-1α对脑缺血再灌注损伤大鼠脉络丛组织(HE染色)形态学变化的影响:缺血再灌注6h后及12h后,脉络丛组织形态结构尚完整,上皮细胞排列整齐,无明显细胞水肿,细胞间隙大小基本正常,局部可见淋巴细胞浸润,此时治疗组与对照组脉络丛组织大致形态上无明显区别。脉络丛轮廓存在,大体结构完整,局部可见上皮细胞间隙增宽。缺血再灌注24h后,神经组织病理性改变较前面时间点加重,脉络丛结构松散,细胞间隙扩大,脉络丛上皮细胞高度水肿,部分细胞出现凋亡改变,血管内皮细胞肿胀,部分血管内皮断裂,脉络丛结构完整性破坏,此时间点观察到HIF-1α质粒治疗组破坏程度轻于PBS对照组。缺血再灌注72h后,脉络丛上皮细胞凋亡减少,水肿程度未见减轻,与PBS对照组相比HIF-1α质粒治疗组细胞间隙没有进一步增宽,且内皮细胞破坏减少。缺血再灌注7d后,脉络丛组织结构恢复原有轮廓,上皮细胞肿胀程度减轻,部分区域可见纤维增生,为无细胞结构的纤维连接,此时间可以观察到与PBS对照组相比HIF-1α质粒治疗组上皮细胞恢复更完整,血管内皮细胞轮廓更清晰,细胞间隙较之前紧凑。5 HIF-1α对大鼠脑缺血再灌注损伤后脉络丛细胞超微结构的影响:PBS对照组与HIF-1α注射组在6h和12h均见内皮细胞水肿,细胞间紧密连接松解,核膜及各种细胞器损伤,少量吞饮小泡;治疗24h后两组间开始出现差异,HIF-1α注射组吞饮小泡数量增加较PBS组明显,且细胞间紧密连接松解相对较少;治疗72h后,HIF-1α注射组细胞器及吞饮小泡数量明显多于PBS对照组,细胞器水肿现象明显缓解,细胞间紧密连接开始出现明显修复迹象,同HIF-1α注射组相比,PBS对照组细胞间隙较宽,紧密连接恢复不明显,细胞间隙封闭和不如治疗组;治疗7d后,HIF-1α注射组细胞线粒体和粗面内质网等细胞器已恢复正常,整个内皮细胞处于恢复过程中,PBS对照组细胞器恢复不如HIF-1α注射组,尤其以分泌型细胞器如粗面内质网,高尔基体等最为明显,说明其分泌功能的恢复不如治疗组,此时间点HIF-1α注射组细胞间紧密连接已接近正常,而PBS对照组细胞间隙封闭仍不完全。结论:1大鼠脑缺血再灌注损伤后,经颈外-颈内动脉注射重组pcDNA3.1-HIF-1α质粒可减少脑组织的梗塞面积,具有神经保护作用。2大鼠脑缺血再灌注损伤后早期给予外源性HIF-1α基因治疗可以减轻脉络丛血管内皮细胞的损伤。3大鼠脑缺血再灌注损伤后,外源性HIF-1α可以有效修复脉络丛血管内皮细胞间的紧密连接。4大鼠脑缺血再灌注损伤后,外源性HIF-1α可以显著上调脉络丛神经分泌功能。