论文部分内容阅读
第一部分COX-2在多发性骨髓瘤中的表达及其抑制剂Meloxicam对多发性骨髓瘤细胞增殖和凋亡的作用目的:研究环氧化酶-2(cooxygenase-2,COX-2)在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)中的表达及其抑制剂Meloxicam对MM细胞的作用。方法:采用多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226、KM3、U266为研究对象,以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养各MM细胞系,分别以不同浓度的Meloxicam作用不同的时间后,应用台盼蓝拒染法测定细胞活力变化,MTT法检测细胞的增殖变化;Annexin-V/PI双染流式细胞术、TdT介导的脱氧尿苷三磷酸末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡;荧光显微镜下观察AO/EB染色后的细胞凋亡形态变化;RT-PCR及Western blot方法检测COX-2的mRNA和蛋白水平表达。结果(:1)与对照组相比,10μM、25μM、50μM浓度的Meloxicam可明显抑制RPMI8226、KM3的增殖(P<0.01),并呈时间和剂量依赖,而对U266细胞及正常人外周血单个核细胞的增殖无明显影响;(2)Annexin-V/PI双标法流式细胞仪和TUNEL法检测细胞的凋亡,Meloxicam作用后RPMI8226、KM3细胞凋亡百分率显著增高(P<0.01),AO/EB染色免疫荧光显微镜下可见典型的凋亡细胞形态学变化;(3)Meloxicam能明显抑制RPMI8226、KM3细胞COX-2 mRNA的表达以及包括U266细胞在内的三种MM细胞COX-2蛋白的表达。结论:MM细胞存在COX-2的表达;Meloxicam能有效抑制部分MM细胞系的增殖并促其凋亡,作用机制可能与COX-2通路的抑制有关。第二部分siRNA沉默COX-2基因对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖和凋亡的影响及其与Bcl-2的关系研究目的:研究体外COX-2小干扰RNA(COX-2 siRNA)对人MM细胞系RPMI8226增殖凋亡的作用及其与Bcl-2基因家族的关系,确证COX-2途径在MM中的作用。方法:采用Nucleofector?技术将以COX-2基因exon 5为靶标的siRNA片段转入RPMI8226细胞内,分为转染组RPMI8226细胞(RPMI8226siRNA ),未处理组RPMI8226细胞(RPMI8226Untreated)及空转组RPMI8226细胞(RPMI8226Blank);COX-2基因的转录和翻译表达水平采用RT-PCR和Western blot方法检测; MTT法检测细胞的增殖,Annexin-V/PI双标法流式细胞仪检测细胞的凋亡变化,其后又以TUNEL法进一步证实凋亡变化情况;Western blot方法检测Bcl-2和Bax的变化。结果(:1)COX-2的小干扰RNA片段能通过Nucleofector?技术成功的转入RPMI8226细胞内,转染效率大于78%;(2)RT-PCR和Western blot结果证实siRNA能显著抑制RPMI8226细胞的COX-2 mRNA和蛋白水平的表达;(2)COX-2 siRNA能以时间依赖性方式抑制RPMI8226细胞的增殖,RPMI8226siRNA细胞的OD值倍增时间为54.6小时,明显长于RPMI8226Untreated细胞(30小时,P<0.001)和RPMI8226Blank细胞(32小时,P<0.001)。同时能显著诱导其凋亡(0小时自发性凋亡率为6.52%±0.32%, 12小时为12.53%±2.52%, 24小时为24.39%±3.51% ,48小时为36.48%±4.96%) (P<0.01) ;(3)COX-2 siRNA转染后,RPMI8226细胞内Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax的表达无明显变化。结论:(1)COX-2小干扰RNA转染能特异性抑制RPMI8226细胞中COX-2的表达,从而抑制RPMI8226细胞的生长并促其凋亡,不依赖于Bcl-2;(2)COX-2通路在MM细胞中起着重要作用。第三部分12-LOX在MM细胞RPMI8226中的表达及黄芩素拮抗MM作用的机制研究目的:研究12-脂氧合酶(12-loxygenase,12-LOX)在MM细胞RPMI8226中的表达、对MM细胞增殖和凋亡的意义以及黄芩素对RPMI8226细胞的作用和机制。方法:采用多发性骨髓瘤细胞系RPMI8226为研究对象,常规培养后分别以不同浓度(0μM、20μM、40μM、60μM)的黄芩素作用不同的时间(0h、24h、48h、72h),应用台盼蓝拒染法测定各时间点细胞活力变化,MTT法检测细胞的增殖变化;Annexin-V/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,Wright-Gimesa染色后观察细胞凋亡形态变化;PI流式检测细胞周期分布;RT-PCR及Western blot方法检测mRNA和蛋白的表达变化。结果:(1)人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞存在12-LOX的表达;(2)0μM、20μM、40μM、60μM浓度的黄芩素作用不同时间后,以时间和剂量依赖型方式抑制RPMI8226的增殖(P<0.01),24小时IC50为80μM,48小时IC50为46μM,72小时IC50为30μM;12-LOX底物12-HETE能逆转40μM黄芩素对RPMI8226抑制增殖作用;(2)Annexin-V/PI双标法流式细胞仪和TUNEL法检测细胞的凋亡,黄芩素作用后RPMI8226凋亡百分率显著增高(P<0.01),Wright-Gimesa染色后可见凋亡细胞形态学变化;(4)与对照组(71.5±12.1)%相比,20～60μM黄芩素分别导致(79.4±15.2)%～(83.4±15.6)%的细胞发生G0/G1期周期停滞,同时S期细胞比例明显减少,为(21.5±5.0)%～(5.9±2.2)%,并呈剂量依赖性变化,G2/M期细胞比例无明显变化;(5)20～60μM的黄芩素处理RPMI8226细胞后,12-LOX蛋白水平呈浓度及时间依赖性降低(与对照组相比,P>0.01);黄芩素为60μM浓度时,几乎完全抑制了12-LOX的表达;(6)20μM的黄芩素即能抑制MM细胞RPMI8226中Erk1/2的活化,并呈时间依赖性改变结论:MM细胞存在12-LOX的表达并可能在MM细胞的增殖和凋亡中起着重要作用;黄芩素能抑制RPMI8226细胞的增殖并促其凋亡,其作用机制可能与抑制12-LOX及Erk1/2活化有关。