小剂量超短波联合骨髓间充质干细胞移植治疗对大鼠脊髓损伤后巨噬细胞亚型分化的影响的实验研究

来源 :中国医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ayahaha
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目的:观察小剂量超短波(ultrashort wave,USW)联合骨髓间充质干细胞(bonemarrow stromal cells,BMSCs)移植治疗对大鼠脊髓损伤后巨噬细胞亚型分化的影响以及超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticle,SPIO)对骨髓间充质干细胞的长期示踪标记效果。  方法:取4周龄GFP+大鼠分离培养BMSCs,用浓度为25μg/ml Fe的SPIO标记第3代BMSCs,通过CCK-8实验检测SPIO标记对干细胞增殖影响,普鲁士蓝染色测定标记效果,激光共聚焦显微镜、透射电镜观察SPIO在干细胞内的分布。雌性SD大鼠16只,随机分为2组:BMSCs移植组(BMSCs组,n=8)手术后于T10损伤区域立即注入密度为1×106/μl SPIO标记的BMSCs5μl;联合治疗组(USW+BMSCs组,n=8)手术后于T10损伤区域立即注入密度为1×106/μl的SPIO标记的BMSCs5μl,于SCI术后24h后给以小剂量的USW治疗(最大输出功率40 W,实际输出功率11.58 W)治疗,7 min/次,1次/d,至取材前;4w后取材分别行石蜡切片在激光共聚焦显微镜下观察GFP+BMSCs,并做普鲁士蓝染色;制作透射电镜标本并观察。102只Sprague-Dawley大鼠随机分为5组:假手术组(sham组)、对照组(control组)、USW治疗组(USW组)、BMSCs移植组(BMSCs组)、联合治疗组(USW+BMSCs组)。sham组(n=6)在暴露硬脊膜后,不予任何处理直接缝合;control组(n=24)采用Allen打击法建立脊髓损伤模型,不给予任何治疗;USW组(n=24)在SCI后第2天开始给予受损部位小剂量超短波治疗;BMSCs组(n=24)在SCI后立即于受损部位立即注入密度为1×106/μl BMSCs5μ l;USW+BMSCs组(n=24)在SCI后立即于受损部位立即注入密度为1×106/μl BMSCs5μ l,并于SCI后第2天行小剂量超短波治疗,至取材前。于造模后1d、3d、7d行BBB评分评定大鼠的后肢运动功能,免疫组织化学染色检测巨噬细胞-小胶质细胞胞质抗原(ED-1)、一氧化氮合酶(iNOS)和精氨酸酶-1(Arg-1)的表达,观察USW联合BMSCs移植治疗对大鼠SCI后巨噬细胞极化方向的影响,并初步探讨其对脊髓损伤后减轻炎症反应的作用机制。  结果:实验结果表明,①BBB评分结果显示,SCI术后1-3d,同组内不同时间点BBB评分均有所增高,但组间比较没有统计学差异性(P>0.05),在术后7d,USW组、USW+BMSCs与control组相比,组间差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);②ED-1阳性细胞数量在SCI术后7d至高峰,USW组、BMSCs组、USW+BMSCs组ED-1表达量在术后3d时较control组少(P<0.001,P<0.001,P<0.01),有统计学意义。术后7d,USW组、BMSCs组、USW+BMSCs组ED-1阳性蛋白表达量少于control组,且差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05,P<0.001)。USW+BMSCs组的ED-1表达在术后7d较BMSCs组相比有明显下降(P<0.05)。③iNOS阳性IOD值测定:SCI术后1-7diNOS阳性细胞表达:术后3d,USW组、BMSCs组和USW+BMSCs组与control组相比iNOS的表达减少(P<0.05,P<0.001,P<0.001);BMSCs组、USW+BMSCs组与USW组相比iNOS的表达减少,且差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05).术后7d,USW组、BMSCs组和USW+BMSCs组与control组相比iNOS表达减少(P<0.05,P<0.01,P<0.01);④Arg-1蛋白阳性表达较sham组均增多,4个实验组都是在第3d达到高峰。第7d BMSCs组和USW+BMSCs组Arg-1表达量高于control组,且差异有统计学意义(P<0.01,P<0.01)。⑤SPIO标记第3代GFP+BMSCs在激光共聚焦显微镜下观察到细胞核和细胞浆均有绿色荧光和SPIO阳性颗粒,干细胞呈长梭形。高倍镜下可见SPIO颗粒主要聚集在细胞核膜周围,细胞质内也有分布,标记率达98%以上,和普鲁士蓝染色结果相一致。细胞质中的膜性细胞器如溶酶体和线粒体中均出现团块状或点状分布的SPIO颗粒。但细胞核内并没有SPIO。在SCI术后4w后取材透射电镜和激光共聚焦荧光显微镜下观察发现有BMSCs存活,且细胞呈多形性,细胞质内可见明显的SPIO颗粒。  结论:小剂量USW和BMSCs移植联合治疗对SCI早期运动功能恢复有促进作用,以USW的作用为主。小剂量USW和BMSCs移植联合治疗可减少SCI损伤处巨噬-小胶质细胞的表达,并促进巨噬细胞M1型向M2型极化,且二者联合治疗有协同作用,但以BMSCs作用为主。SPIO对BMSCs的标记效果良好,对干细胞增殖活性没有影响且标记率高,是一种可用于长期示踪的干细胞标记物。
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