糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病众多慢性并发症中最常见和最严重的一种,DN的重要病理基础是肾小球系膜细胞增生和细胞外基质(ECM)堆积诱发肾小球硬化,TGF-β1是最重要的致纤维化因子。研究表明,miR-130b在DN患者外周血和DN小鼠肾组织中均显著降低,提示miR-130b可能受TGF-β1调控而发生表达水平的改变,而TGF-β1是诱导DN发生的关键调节因子,从而加重肾脏纤维化,可能的机制主要是利用TGF-β1/Smads途径调节下游纤维化因子ColI、ColIV、FN等靶基因的表达,但其具体的调控机制尚不清楚。因此,阐明TGF-β1/Smads和mi R-130b之间的相互作用,对了解和防治糖尿病肾病具有十分重要意义。研究目的:本项目重点研究人肾小球系膜HMC细胞在高糖环境、TGF-β1诱导及转染miR-130b mimics/inhibitor后HMC细胞纤维化的内在联系,揭示mi R-130b在DN中纤维化过程中的作用机制,为DN的预防、诊断和治疗提供新思路。研究方法:1.临床标本已征得河南科技大学伦理委员会审核批准及病人本人同意并签署知情同意书,病理科明确确诊为DN的肾脏组织及正常肾脏组织做HE,Masson染色和免疫组化,观察病变组织和正常组织的区别。2.用高糖(25 mmol/l)及低糖(5.5 mmol/l)体外培养人肾小球系膜HMC细胞,观察高低糖与HMC细胞的纤维化关系。3.分别将mi R-130b mimics、inhibitor及mi R-130b control转染到HMC细胞中,观察miR-130b和纤维化蛋白因子的关系。4.TGF-β1作为干预因素,设置不同时间点,观察在不同浓度的TGF-β1(0 ng/ml、10 ng/ml和30 ng/ml)下,TGF-β1与HMC细胞的miR-130b及纤维化蛋白因子的相互作用关系。5.在TGF-β1诱导下,分别转染miR-130b mimics、inhibitor及miR-130b control到HMC细胞中,观察miR-130b并检测纤维化蛋白因子及Smad2/3/4蛋白的表达情况。结果:1.HE染色结果显示Col I、Col IV,FN纤维化蛋白因子在DN病人的肾脏组织(病变)与正常肾脏组织(正常)的切片染色显示,肾小球硬化,基底膜增厚变红,系膜基质增生;Masson染色结果显示:ColI、ColIV和FN蛋白因子病变与正常组织相比基底膜增厚,染成蓝色组织明显增多、粗壮;免疫组化显示ColI、ColIV和FN蛋白因子在病变较正常组织染片中,系膜组织周边棕色颗粒显著增多,病变组织系膜增厚。2.低/高糖培养的HMC细胞,在低糖组和高糖组,miR-130b的表达量是1.00,1.42±0.03;ColI mRNA、Col IV mRNA、FN mRNA的表达量别是1.00、1.43±0.02,1.00、1.49±0.05,1.00、1.89±0.06;对western blot结果灰度值分析显示,ColI蛋白、ColIV蛋白、FN蛋白的表达量低糖组较高糖组分别是1.00、1.36±0.01,1.00、1.53±0.04,1.00、1.93±0.05;组间相比,差异显著,具有统计学意义(P<0.01);免疫荧光结果显示高糖组较低糖组ColI无明显差异,ColIV、FN胞核蓝染变淡,胞质绿色荧光更明亮,纤维化增强。3.转染mi R-130b control组较miR-130b mimics组,mi R-130b的表达量分别为1.00、5.11±0.70,Col I mRNA的表达量分别为1.00、1.61±0.19,ColIV mRNA分别为1.00、3.17±1.00,FN mRNA的表达量分别为1.00、3.84±0.93;转染mi R-130b control组较miR-130b inhibitor组、mi R-130b的表达量分别为1.00、0.31±0.02,ColI mRNA的表达量分别为1.00、0.58±0.02,ColIV mRNA表达量分别为1.00、0.85±0.03,FNm RNA的表达量是1.00、0.09±0.04;各组间相比,差异显著,均具有统计学意义(P<0.01)。western blot结果灰度值分析显示,转染mi R-130b control组与mi R-130b mimics组相比,ColI蛋白的表达量是1.00、1.52±0.01,ColIV蛋白的是1.00、1.22±0.02,FN蛋白的表达量是1.00、1.98±0.06;转染miR-130b control组较miR-130b inhibitor组,Col I蛋白的表达量是1.00、0.66±0.02,ColIV蛋白量是1.00、0.39±0.01,FN蛋白量是1.00、0.60±0.10;各组间相比,差异显著,均具有统计学意义(P<0.01)。免疫荧光结果显示mi R-130b mimics组与miR-130b对照组相比,Col I、ColIV和FN纤维化蛋白胞核蓝染较淡,胞质内的绿色荧光更明亮;miR-130b inhibitor组与mi R-130b control组相比,ColI、ColIV和FN纤维化蛋白胞质的绿色荧光很弱。4.高糖组10 ng/ml、30 ng/ml的TGF-β1分别处理24h和48h时,mi R-130b的表达量分别是1.00、1.48±0.27、1.51±0.04、1.24±0.06、2.33±0.23、2.60±0.21;ColIm RNA的表达量分别是1.00、1.27±0.11、1.81±0.11、2.09±0.12、3.32±0.30、2.28±0.23,ColIVmRNA的表达量分别是1.00、1.37±0.01、1.51±0.17、1.38±0.06、1.69±0.32、1.52±0.58,FNmRNA的表达量分别是1.00、1.31±0.09、1.68±0.06、2.25±0.18、4.72±0.70、4.21±0.21,各组数据相比较综合分析,10 ng/ml48h时纤维化最强。对western blot条带灰度值分析显示,Col I蛋白的表达量分别是1.00、1.26±0.07、1.12±0.06、2.54±0.09、3.04±0.15、2.85±0.22,ColIV蛋白的表达量分别是1.00、1.67±0.18、3.14±0.08、3.02±0.12、4.66±0.12、4.52±0.10,FN蛋白的表达量分别是1.00、1.31±0.03、1.43±0.02、1.34±0.03、2.08±0.02、1.41±0.03,各组数据相比较综合分析,同qRT-PCR结果一致,10 ng/ml48h时纤维化最强。免疫荧光结果显示Col I、ColIV和FN蛋白并不完全随着TGF-β1浓度及处理时间的增加出现更明亮的红色荧光,在几个实验组中10ng/ml TGF-β1诱导48h时纤维化表现较强。5.TGF-β1诱导后,转染mi R-130b control组较miR-130b mimics组,mi R-130b的表达量是1.00、17.40±2.16,Col ImRNA的表达量是1.00、2.36±0.22,ColIVmRNA的表达量则是1.00、1.21±0.04,FNmRNA的表达量为:1.00、2.21±0.31;转染miR-130b control对照组较miR-130b inhibitor组,miR-130b的表达量是1.00、0.40±0.02,ColImRNA的表达量是1.00、0.54±0.03,Col IVmRNA的表达量是1.00、0.70±0.11,FNmRNA的表达量则是1.00、0.48±0.11,各组间相比,差异显著,均具有统计学意义(P<0.01)。TGF-β1诱导后,对western blot条带进行灰度值分析,转染miR-130b control组较miR-130b mimics组,Col I蛋白的表达量是1.00、1.27±0.01,Col IV蛋白的表达量是1.00、2.89±0.18,FN蛋白的表达量则是1.00、1.28±0.03;转染miR-130b control对照组较miR-130b inhibitor组,,ColI蛋白的表达量分别是1.00、0.90±0.01,ColIV蛋白的表达量分别是1.00、0.71±0.05,FN蛋白的表达量分别是1.00、0.60±0.01,各组间相比,差异显著,均具有统计学意义(P<0.01)。免疫荧光结果显示,TGF-β1诱导后,ColI、ColIV、FN纤维化蛋白miR-130b mimic实验组较miR-130b control对照组胞质的红色荧光更明亮,纤维化增强;Col I、ColIV、FN纤维化蛋白mi R-130b inhibitor组较miR-130b control对照组则胞质的红色荧光暗淡,几乎表现不出来,纤维化减弱。6.无TGF-β1诱导,转染miR-130b control组较mi R-130b mimics组,Smad2 mRNA的表达量分别是1.00、2.69±0.16,Smad3 mRNA的表达量分别为1.00、2.78±0.12,Smad4 mRNA的表达量则是1.00、2.24±0.09;TGF-β1诱导后,转染miR-130b control组较mi R-130b mimics组,Smad2 mRNA的表达量分别为1.00、1.40±0.06,Smad3 mRNA的表达量分别是1.00、1.28±0.02,Smad4 mRNA的表达量则是1.00、1.37±0.05;无TGF-β1诱导,转染mi R-130b control组与mi R-130b inhibitor组相比,Smad2 mRNA的表达量0.24±0.01,Smad3 mRNA的表达量0.26±0.01,Smad4 mRNA的表达量为0.24±0.02;TGF-β1诱导后,转染miR-130b control组与mi R-130b inhibitor组相比,Smad2 mRNA的表达量是0.74±0.04,Smad3 mRNA的表达量是0.82±0.06,Smad4 m RNA的表达量是0.73±0.05,各组间相比,差异显著,均具有统计学意义(P<0.01)。对western blot条带进行灰度值分析,无TGF-β1诱导,转染miR-130b control组较miR-130b mimics组,P-Smad2 mRNA的表达量是1.00、2.31±0.09,t-Smad2 mRNA的表达量是1.00、2.06±0.05,P-Smad3 mRNA的量分别是1.00、2.10±0.11,t-Smad3 mRNA的表达量为:1.00、1.56±0.01,Smad4 mRNA的表达量则是1.00、3.24±0.19;TGF-β1诱导后,转染miR-130b control组较miR-130b mimics组,P-Smad2 mRNA的表达量是1.00、1.40±0.06,t-Smad2 mRNA的表达量是1.00、1.36±0.05,P-Smad3 mRNA的表达量是1.00、1.35±0.05,t-Smad3 mRNA的表达量是1.00、1.19±0.01,Smad4 mRNA的表达量则是1.00、1.17±0.04。无TGF-β1诱导,转染miR-130b control组较miR-130b inhibitor组,对western blot条带进行灰度值分析,P-Smad2 mRNA的表达量分别是1.00、0.81±0.04,t-Smad2 mRNA的表达量分别是1.00、0.76±0.05,P-Smad3 mRNA的表达量分别是1.00、0.90±0.08,t-Smad3 mRNA的表达量分别是1.00、0.54±0.03,Smad4 mRNA的表达量则是1.00、0.47±0.03;TGF-β1诱导后,转染miR-130b control组较mi R-130b mimics组,P-Smad2 mRNA的表达量是1.00、0.80±0.05,t-Smad2 mRNA的表达量分别是1.00、0.91±0.02,P-Smad3 mRNA的表达量分别是1.00、0.68±0.03,t-Smad3 mRNA的表达量为1.00、0.71±0.02,Smad4 mRNA的表达量则是1.00、0.90±0.04,各组间相比,差异显著,均具有统计学意义(P<0.01)。免疫荧光结果显示,TGF-β1诱导后,Col I、Col IV、FN纤维化蛋白miR-130b mimic实验组较miR-130b control组胞核蓝染明亮,胞质的红色荧光也更明亮;Col I、ColIV、FN纤维化蛋白mi R-130b inhibitor实验组较miR-130b control对照组则胞核、胞质均为暗淡的红色荧光。结论:1.mi R-130b和HMC细胞的纤维化正相关;2.TGF-β1能够诱导HMC细胞的纤维化,且几个实验组中,在10ng/mlTGF-β1诱导48h时,HMC细胞纤维化较强;3.抑制miR-130b,能够抑制TGF-β1诱导的纤维化,但对TGF-β1 mRNA的表达量基本无影响;4.TGF-β1能诱导HMC细胞的纤维化,且在几个实验组中TGF-β1浓度为10 ng/ml处理48 h时纤维化较强;5.TGF-β和miR-130b促进HMC细胞纤维化可能主要是由TGF-β/Smads信号通路介导的,Smad2和Smad3是重要的调控因子,其中Smad3发挥主要作用。