纳米氧化锌(ZnO NPs)被广泛应用于工业、日用品、生物医学等领域,对人类健康的潜在安全性问题备受关注。研究表明,ZnO NPs可通过呼吸道、消化道等途径进入人体,还可经血循环到达身体其他组织器官,引发相应器官损伤。目前认为,ZnO NPs毒性效应机制主要是由其诱导氧化应激导致的,氧化应激可引发炎症、DNA损伤及细胞凋亡等。氧化应激也可引起靶细胞的应激反应,包括基因表达改变。然而,目前ZnO NPs关键响应基因认识并不全面。在本研究中,我们首先评价ZnO NPs对人肺泡上皮细胞A549的毒性效应。表征鉴定结果显示,我们实验用的ZnO NPs平均粒径为37.32nm,呈立体晶体状,分散性较好且稳定。利用CCK-8检测ZnO NPs作用于A549细胞后的相对细胞活力,结果显示,ZnO NPs对A549细胞显著抑制浓度为7.5 μg/mL,并且随着ZnO NPs浓度和时间的增加,细胞活力逐渐下降。此外,我们检测ZnO NPs作用于细胞后总活性氧(ROS)生成情况,发现ROS含量随ZnO NPs浓度增加呈现递增趋势,7.5 μg/mL引起ROS含量升高至对照组2倍。利用PI和Annexin V-FITC染色法检测ZnO NPs处理后细胞凋亡情况。结果显示,7.5 μg/mL的ZnO NPs引起Sub-G1期及Annexin V阳性细胞数显著增加,说明ZnO NPs处理引起细胞凋亡。mRNA翻译的调控在基因表达中发挥有重要作用,然而ZnO NPs对翻译的影响目前尚没有研究。于是,我们首先检测了 ZnO NPs作用于A549细胞后核糖体的分布情况,结果显示,ZnO NPs处理后多聚核糖体(翻译效率高)比例显著降低,而单核糖体(翻译效率低)比例显著增加,说明整体翻译水平被抑制。此外,我们检测ZnO NPs处理后翻译调控蛋白4EBP1、eIF2α的磷酸化修饰水平,发现4EBP1的磷酸化水平逐渐降低,eIF2α的磷酸化水平逐渐升高,进一步说明ZnO NPs抑制细胞mRNA翻译。活性氧清除剂NAC预处理后,ZnO NPs对细胞翻译的抑制效应得以恢复,说明ZnO NPs通过氧化应激抑制细胞整体翻译水平。随后,我们利用核糖体展示技术(Ribo-seq)筛选ZnONPs处理后翻译水平差异表达基因。以两倍变化为标准筛选到翻译水平差异表达基因2667个,其中2597个基因翻译下调,70个基因翻译上调。GO功能性分析发现翻译差异表达基因在生物学过程、细胞成分和分子功能中分别富集于细胞黏附、各种细胞膜成分和钙离子结合等。KEGG通路分析则发现差异表达基因主要富集于溶酶体、细胞外基质-受体相互作用以及各种信号通路如Notch、PI3K-Akt、Wnt等。STRING数据库聚簇分析发现,翻译表达上调基因主要集中在两个功能丰富的簇集上,一个是转录因子簇(包括FOS、FOSB、JUNB、EGR1等),另一个是核糖体蛋白簇(包括RPL22、RPL10、RPS27A 等)。我们进一步对ZnO NPs处理后核糖体蛋白簇中变化最为显著的RPL22进行验证。结果显示,ZnO NPs处理A549细胞后RPL22的蛋白水平上调,而mRNA水平没有明显变化,提示ZnO NPs在翻译水平促进RPL22表达。为明确核糖体蛋白RPL22在ZnO NPs诱导A549细胞凋亡中的作用,我们利用shRNA抑制内源RPL22表达后,检测细胞凋亡情况。结果表明,与对照组相比,敲降RPL22组Sub-G1期(凋亡细胞)细胞数显著减少,说明RPL22介导ZnO NPs促进的细胞凋亡。综上所述,本论文发现:1)ZnO NPs引起A549细胞活力降低、ROS升高和细胞凋亡;2)ZnO NPs抑制A549细胞翻译,降低蛋白质合成速率;3)ZnONPs处理A549细胞1小时可影响约3,000个mRNA的翻译,差异表达基因功能富集于细胞黏附、溶酶体等;4)ZnONPs影响包括RPL22在内的多个核糖体蛋白的翻译上调;5)核糖体蛋白RPL22介导ZnO NPs诱导的细胞凋亡。本论文首次系统研究ZnO NPs短时间作用对细胞翻译的影响,证明ZnO NPs引起的翻译改变参与其毒性效应。对差异基因功能的进一步深入研究将有助于阐明ZnO NPs毒性效应机制。