一株枯草芽胞杆菌的分离鉴定及其杀虫活性的研究

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鳞翅目(Lepidoptera)是一种世界性危害广的害虫,每年给全球造成上亿美元的损失。因此深入挖掘丰富的菌株资源,筛选具有广谱高效杀虫毒力的菌株,对构建广谱高效工程菌、研制环保微生物杀虫剂具有重要的理论及实践意义。本论文以从土壤中自行分离的219株芽胞杆菌中筛选的一株枯草芽胞杆菌为研究对象,通过菌落形态观察、光学显微镜、激光共聚焦显微镜等进行镜检菌体形态以及16S rRNA基因同源性分析等一系列方法鉴定,该株细菌属枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis,命名为HX08,并将其16S rRNA基因序列提交上Genbank数据库,获得了登陆号KF774302。同时,从该菌株的生理生化特性方面进行了验证,如革兰染色实验、柠檬酸盐利用、明胶液化、吲哚实验、甲基红实验、V.P实验、卵磷脂酶实验、淀粉水解实验、纤维素水解实验、L-阿拉伯糖水解实验、D-葡萄糖水解实验、D-木糖水解实验等。并对该菌株的生长特性进行了一系列初步研究,包括生长曲线、最适pH值、培养过程中pH值变化情况及抗生素抗性等。研究了该菌株发酵不同时期下不同浓度的样品对棉铃虫幼虫(Helicoverpa armigera)的杀虫活性及致死毒力,结果发现,HX08菌株在60h发酵时间段对棉铃虫的致死效果最好。通过对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、铜绿杆菌、产气肠杆菌等多种病原细菌进行抑菌实验,发现该菌株在60h发酵时间段对鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌菌株的抑菌效果最明显。对该菌株发酵液提取的活性蛋白进行了初步研究,建立了HPLC技术分离体系,使用H20做流动相,以0.5mL/min流速洗脱,检测波长分别为215nm、254nm和280nm,收集第15mL收集管处即保留时间为31min的2号峰粗分离物活性较高。并切取SDS-PAGE胶目的蛋白质条带酶解,利用质谱(LTQ-MS)技术进行了分子特性分析,鉴定发现杀虫活性蛋白成分为草酸脱羧酶。本研究为丰富枯草芽胞杆菌菌种资源,挖掘微生物活性产物基因资源,进一步研究该菌的杀虫和抗菌活性物质奠定了重要基础。
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