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目的:毒品滥用,尤其是新型的化学合成毒品冰毒、摇头丸等苯丙胺类毒品的滥用是目前世界各国亟待解决的医学及社会问题之一。甲基苯丙胺(methamphetamine,METH),是苯丙胺类精神兴奋剂,其盐酸盐为无色透明的晶体,因此俗称“冰毒”。其在近年来成为全球滥用的毒品,超过了传统海洛因等毒品。METH分子是脂溶性,极易透过血脑屏障,造成中枢神经系统损伤。长期滥用METH可导致明显的行为、精神及认知功能障碍,如躁狂、幻听、幻视、焦虑、亢奋、精神分裂症等,且滥用者大多以青少年为主,社会危害极其严重。但是,目前关于METH的成瘾性和神经毒性机制研究仍不明确,尚无有效防治药物。目前认为METH可通过氧化应激、氨基酸兴奋性毒性及线粒体功能紊乱机制等经典途径导致神经毒性损伤。许多研究指出,METH引起纹状体多巴胺末梢神经毒性,表现为纹状体的多巴胺递质、多巴胺转运体(DAT)及多巴胺受体水平的降低。胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)是由33个氨基酸组成的多肽并通过与CCK1,CCK2受体结合发挥作用。CCK有多种生物分子形式,其中以CCK-8在脑中存在最为丰富。CCK-8可以参与调节饮食、痛觉、学习记忆、焦虑及精神疾病,也参与调节DA、GABA等神经递质的释放,另外CCK-8在其他研究领域研究中发现具有抗氧化应激、抗炎功能,并且CCK-8在神经损伤模型中发挥神经保护作用。这些研究表明,CCK-8对METH引起的神经毒性可能具有保护作用。基于以上研究背景,本实验将研究甲基苯丙胺对PC12细胞(大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株,可作为神经细胞模型)的损伤作用,观察氧化应激在损伤中是否发挥了作用,以及CCK-8对这种损伤作用的影响及机制,为CCK-8对神经细胞损伤的保护机制研究提供新思路。方法:1应用RT-PCR及琼脂糖电泳方法鉴定PC12细胞表面CCK1R(CCK1 receptor)和CCK2R(CCK2 receptor)的存在。2 METH及CCK-8作用对PC12细胞的影响。应用MTT法观察0.1、0.5、1、2、4 m M METH分别作用24 h对PC12细胞存活率的影响;0.1、0.5、1μM CCK-8单独或与2 m M METH共同作用对PC12细胞存活率的影响。3 METH与CCK-8对敲低CCK1R和CCK2R的PC12细胞存活率的影响。应用RNAi转染技术分别敲减PC12细胞CCK1R和CCK2R,并通过RT-PCR及琼脂糖电泳方法验证,建立CCK1R和CCK2R分别敲低的PC12细胞模型;然后MTT法观察2 m M METH与1μM CCK-8分别单独和共同作用24 h对PC12细胞存活率的影响。4 METH与CCK-8对过表达CCK1R与CCK2R的HEK293细胞存活率的影响。应用MTT实验观察1、2、4、6、8、10 m M METH分别作用24 h对HEK293细胞存活率的影响;0.1、0.5、1μM CCK-8单独对HEK293细胞存活率的影响;在本实验室构建的HEK293细胞系,HEK293-CCK1R细胞系,HEK293-CCK2R细胞系上分别用MTT法观察4 m M METH与0.1、0.5、1μM CCK-8单独或共同作用对这三种细胞存活率的影响。5 METH与CCK-8对PC12细胞的氧化应激影响。应用ROS荧光探针-DHE生化试剂盒免疫荧光的方法通过荧光显微镜观察1 m M METH与1μM CCK-8分别单独作用和共同作用于PC12细胞15 min、30 min、45 min、60 min后判断PC12细胞活性氧(ROS)含量的变化和多少。采用MDA生化试剂盒方法检测1 m M METH分别处理PC12细胞5 min、15 min、25 min、30 min后细胞丙二醛(MDA)的含量变化;1 m M METH与1μM CCK-8分别单独作用和共同作用于PC12细胞15 min后细胞MDA含量变化。6 METH与CCK-8处理,对PC12细胞内P47phox、gp91phox、p-P47phox蛋白表达的影响。Western blot方法检测Nox复合物中的P47phox、gp91phox以及P47phox活化磷酸化后的p-P47蛋白的表达;1 m M METH分别作用2 min、4 min、6 min、8 min、10 min对PC12细胞P47phox、gp91phox、p-P47蛋白的影响;1 m M METH与1μM CCK-8分别单独作用和共同作用于PC12细胞4 min后PC12细胞后对两种蛋白的影响。7 METH与CCK-8对P47phox、gp91phox相互作用的影响。应用免疫共沉淀方法检测P47phox、gp91phox两种蛋白之间的相互作用;1 m M METH与1μM CCK-8分别单独作用和共同作用于PC12细胞4 min后分别检测互沉后两种蛋白表达的变化。8以上数据用均数±标准误(Means±S.E.M)表示,用SPSS17.0软件进行统计学分析,各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA),以最小显著差法(Student-Newman-Keuls,SNK)作两两比较,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1 1 PC12细胞受体验证结果提示:PC12细胞表面存在CCK1R和CCK2R两种受体。2 PC12细胞存活率变化:与正常对照组相比0.1、0.5、1μM CCK-8单独作用PC12细胞存活率没有明显变化(P>0.05);1、2、4 m M METH分别作用24 h后PC12细胞存活率明显降低(P<0.001);0.1、0.5、1μM CCK-8与2m M METH共同处理使PC12细胞存活率明显升高(P<0.001)。提示:METH可以直接损伤细胞。3以RNAi转染技术建立CCK1R和CCK2R分别敲低的PC12细胞和本实验室构建的稳转HEK293-CCK1R和HEK293-CCK2R细胞系,与0.1、0.5、1μM CCK-8单独作用后,与正常未转染对照组相比细胞存活率没有明显变化(P>0.05);CCK2R敲低后CCK-8对METH损伤的保护作用降低(P<0.01),而CCK2R过表达使CCK-8对METH损伤的保护作用增加(P<0.01);敲低或过表达CCK1R对METH损伤细胞的存活率没有影响(P>0.05)。提示:CCK-8通过CCK2R保护METH对细胞的损伤作用。提示:CCK-8在本研究中是通过CCK2R保护METH对细胞的损伤作用。4 PC12细胞ROS含量和MDA含量变化:1 m M METH作用组与正常对照组相比ROS和MDA含量均有明显增加(P<0.001);1μM CCK-8能够抑制METH所诱导的ROS和MDA含量增加(P<0.001)。提示:氧化应激参与了METH对细胞的损伤作用,CCK-8可以抑制这种氧化应激损伤。5 METH与CCK-8对PC12细胞内P47phox、gp91phox、p-P47phox蛋白表达的影响。p-P47phox蛋白的表达在METH作用后明显增加(P<0.001),同时给予CCK-8则可减少这种增加(P<0.01);P47phox、gp91phox蛋白的表达则没有明显变化。免疫共沉淀法检测显示,METH使加速了Nox复合物的形成(P<0.05),CCK-8可以翻转这种作用(P<0.05)。提示:METH启动了P47phox的磷酸化,促使Nox复合物的形成,从而诱导了氧化应激损伤;CCK-8可以通过抑制Nox复合物的形成减少氧化应激反应。结论:METH可以诱导PC12细胞发生氧化应激损伤。而CCK-8可以通过与CCK2R受体结合抵抗这种损伤,发挥对神经细胞的保护作用。