RNAi沉默Notch1对人骨肉瘤MG63细胞增殖及凋亡的影响及其机制研究

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目的:本研究拟通过构建靶向Notch1基因的shRNA重组质粒干扰阻断MG63细胞Notch1信号通路后观察其对细胞增殖及凋亡的影响及其检测Bcl-2及Bax蛋白表达变化。方法:(1)设计3对针对Notch1基因不同位点的shRNA片段的真核表达载体,脂质体介导转染转基因细胞MG63,qRT-PCR及Western Blotting分别检测瞬时转染shRNA前后Notch1蛋白及mRNA的表达,筛选出干扰效率最强的shRNA;(2)将筛选出的干扰效率最强的shRNA稳定转染至MG63细胞,利用MTT增殖实验、Annexin V法染色和流式细胞术流式检测MG63细胞增殖及细胞凋亡情况的变化;(3)阻断Notch1信号通路后,利用Western Blotting方法检测MG63细胞中Bcl-2及Bax蛋白变化。结果:(1)成功构建含Notch1shRNA片段的重组质粒,分别命名为shRNAa、b、c,瞬时转染MG63细胞后, Notch1基因的mRNA及蛋白表达水平均下调。其中,shRNAa重组质粒的沉默效应最强,其RNA水平的抑制率为79.66%(p<0.05)。(2)运用shRNAa稳定转染MG63细胞干扰阻断Notch1信号通路后,MTT增殖实验、Annexin V法染色和流式细胞学检测细胞增殖与凋亡状况,与对照组相比,其细胞增殖速度减慢(p<0.05),细胞凋亡增加(p<0.05)。(3)运用shRNAa稳定转染MG63细胞干扰阻断Notch1信号通路后,Western Blotting检测发现MG63-shRNAa细胞的Bcl-2蛋白表达下降,而Bax蛋白表达上调。结论:(1)靶向Notch1基因的shRNA的重组质粒构建成功,含靶向Notch1基因的shRNA的重组质粒能有效阻断Notch1信号通路;(2)RNAi沉默Notch1基因能明显抑制人MG63细胞增殖,促进细胞凋亡,其作用机制可能与调控Bcl-2及Bax蛋白表达有关。
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