实验目的：病毒性心肌炎(VMC)是由嗜心性病毒感染引起的以心肌细胞变性、坏死和间质炎细胞浸润及纤维渗出为主要改变的心肌疾病，几乎所有的病毒均可引起心肌炎症。其中，以柯萨奇B组病毒3（CVB3）具有强嗜心性。本病发病率有逐年增高的趋势，严重威胁儿童和青壮年健康。因此，对CVB3病毒性心肌炎的治疗机制的研究显得迫在眉睫。随着研究的深入，CVB3感染病毒性心肌炎模型的建立，成为目前主要的研究对象。中医虽无病毒性心肌炎之病名，但从本病的发病特点可归于祖国医学的《温病》范畴，根据临床表现特点又可归属于“心悸”、“虚劳”、“心痛”等范畴。近年来，中医药在病毒性心肌炎的临床治疗中，总结出许多有效的用药经验和治疗方法，其疗效确切、安全可靠，充分显示出中医药VMC机制研究的必要性。本课题根据中医基本理论，结合了治疗病毒性心肌炎临床实践，探索出以黄芪、白参、丹参、郁金、麦冬、白茅根等中药组成的益气活血中药复方，为治疗本病的有效方剂。通过本研究以揭示中医药治疗病毒性心肌炎的（VMC）的作用机制，并且针对病原和保护心肌两个方面选择指标。以乳鼠心肌细胞体外培养，建立了CVB3心肌细胞感染模型，并利用改良的抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization SSH）等分子生物学技术，观察受CVB3攻击的宿主细胞与益气活血中药复方治疗组中cytochrome coxidase subunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomalprotein L27a基因表达的变化，从基因水平探讨益气活血中药复方调控病毒性心肌炎的作用机制。进一步证实益气活血法是治疗VMC的有效方法，益气活血中药复方是防治本病的有效方药。实验方法：1、Hela细胞的复苏及培养：将冻存于液氮中的Hela细胞冻存管取出，迅速放入预先加热的37℃水浴箱中，不断摇动复温约30秒，待冻存液溶解，将细胞悬液迅速移入无菌离心管中，加入3ml含10%胎牛血清DMEM培养基，1000rpm离心5min，弃上清，再加入15ml含10%FBS的DMEM培养液，用移液器反复吹打制成单细胞悬液后移入新培养瓶中，于37°C，5％二氧化碳100%饱和湿度的CO2孵育箱中培养，人宫颈癌细胞株Hela为贴壁生长细胞，生长于含有10％特级胎牛血清DMEM细胞培养液中，24h细胞即进入对数生长期，约72h细胞就能长满瓶底，当细胞生长至80％～90%融合时，用胰酶/EDTA将贴壁生长的细胞消化传代，整个过程要求在超净工作台中进行，严格无菌操作。2、益气活血中药复方的细胞毒性测定：将进入对数生长期Hela细胞用胰酶/EDTA消化，台盼蓝染色记录活细胞数（＞95%），细胞计数板计数，调节活细胞浓度为5×105/ml，以每孔0.2ml接种到96孔细胞培养板中，置37℃，5％二氧化碳培养箱中培养24h，当Hela细胞全部贴壁生长时，测定益气活血中药复方最大无毒剂量。吸弃培养液，加入用DMEM培养液配置的益气活血中药复方注射液0.2ml/孔，共计11个浓度梯度，即原液、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512、1：1024，设4个复孔，另设4个加正常细胞生长液的对照孔。分别于24h、48h后，于倒置显微镜下观察细胞生长状态，参考正常对照孔细胞形态，以不引起细胞形态改变的最大药物稀释浓度为最大无毒浓度（TD0）。3、滴定CVB3病毒的毒力：消化后Hela细胞接种于96孔培养板中，待24h后Hela细胞贴壁后，微量移液器吸去培养板中的生长液，每孔以HBSS液分别洗涤2次后，弃去HBSS液。加入含CVB3病毒的DMEM维持液（含2％胎牛血清），CVB3病毒从10倍浓度被稀释到10－1、10－8，每个浓度设4个复孔，另设4个正常对照孔，每孔各加维持液0.1ml，置于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养，分别于24h、48h后观察细胞病变情况，参考正常对照孔细胞形态。4、MTT法测定益气活血中药复方抑制CVB3致心肌细胞死亡的实验：取对数生长期心肌细胞，使用微量移液器每孔加入0.2ml半数组织感染量浓度CVB3病毒，吸附2h，使心肌细胞感染，吸弃含病毒培养液，加入含2％胎牛血清的维持液3ML，轻轻摇晃培养板洗涤细胞一遍后，依次加入含益气活血中药复方的生长液0.2ml/孔，从药物最大无毒剂量起始稀释8个浓度，每个浓度设4个复孔，另设1个调零孔。于CO2细胞培养箱中培养48h，每孔加入0.18ml DMEM培养液后，再加入0.02ml MTT（0.5%MTT）溶液，放入培养箱继续培养4h，吸弃孔内培养液，再加入0.15ml/孔的DMSO，置振荡器上振荡8-10min，使Formazan结晶溶解，于酶标仪上490nm处测量各孔的吸光值（OD）。5、观察益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞细胞色素C氧化酶亚基I、II，ATP6，RP L27a基因表达的影响：通过改良的抑制性消减杂交技术（SSH）测定大鼠细胞CVB3感染组和益气活血中药复方给药组基因表达的差异，并通过荧光RT-PCR对上述结果进行验证。实验结果：1、益气活血中药复方细胞毒性测定结果：益气活血中药复方最大无毒浓度（TD0）为1：128稀释浓度，相当于最大无毒剂量为7.813mg/ml；2、 CVB3病毒的毒力滴定：CVB3病毒使50%培养心肌细胞感染量为1×10-4.5；3、 MTT法测定益气活血中药复方抑制CVB3致心肌细胞死亡的实验结果：应用不同浓度益气活血中药复方干预CVB3攻击后的心肌细胞，结果发现最大无毒剂量干预CVB3攻击后的心肌细胞的吸光度值（OD值）最大（2.326±0.198），与其它稀释度组相比，统计学差异极为显著（P＜0.001）。证实益气活血中药复方最大无毒剂量可明显抑制CVB3感染心肌细胞的死亡，使心肌细胞存活率最高；4、观察益气活血中药复方对CVB3病毒性心肌炎心肌细胞cytochrome c oxidase subunitI， cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomal proteinL27a基因表达的影响：SSH结果显示益气活血中药复方治疗组中cytochrome c oxidasesubunit I，cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthase F0subunit6，ribosomalprotein L27a基因的表达水平比CVB3病毒感染组明显增高，并通过荧光RT-PCR检测上述基因的表达水平，实验结果与SSH结果一致。结论：1.采用新生大鼠原代心肌细胞体外培养方法,成功建立CVB3攻击的心肌细胞感染模型。2.通过观察益气活血中药复方可以上调CVB3病毒性心肌炎心肌细胞基因cytochrome c oxidase subunit I， cytochrome c oxidase subunit II，ATP synthaseF0subunit6，ribosomal protein L27a的表达，证实了具有益气活血功效的中药复方，是通过调节上述基因，来实现治疗病毒性心肌炎的目的。3.本实验进一步证实了益气活血法是治疗VMC的有效法则，而益气活血中药复方是治疗VMC的有效方剂，提示本方在VMC的治疗中具有广阔的应用前景。