论文部分内容阅读
组蛋白可以在磷酸化酶/去磷酸化酶、乙酰化酶/去乙酰化酶、甲基化酶/去甲基化酶等的作用下发生多种修饰作用,不同的修饰作用通过改变组蛋白与DNA的结合情况,进而影响靶基因的转录水平,以便参与到调节基因的表达,影响染色质稳定性,参与生长、发育、分化、衰老等生理过程。沉默调节蛋白Sirtuin是一种依赖NAD+的特殊组蛋白去乙酰化酶,通过NAD+的合成与分解来调控细胞能量代谢以及氧化还原状态。Sirtuin蛋白在动物和酵母中研究的较多,参与延长细胞寿命,DNA损伤修复、保持基因组稳定性以及能量代谢等过程。但植物中存在较少,拟南芥中仅有AtSRT1和AtSRT2,功能尚不完全清楚。已有研究报道,Sir2家族与植物发育、生物胁迫以及激素信号转导等方面有一定的关系,但与非生物逆境的关系与作用机制未有报道。本试验利用RT-PCR方法从哥伦比亚生态型拟南芥中克隆得到AtSRT2基因（AT5G55760）,开放阅读框片段为1122bp,编码373个氨基酸,通过Gateway方法构建植物表达载体pGWB2-AtSRT2,利用农杆菌介导法将植物表达载体转入拟南芥中,成功获得了超表达转基因T2代。将获得的超表达转基因株系（AtSRT2）与野生型（WT）、转入空载体的拟南芥（pGWB2）以及突变体（atsrt2）进行分析,观察在不同盐碱胁迫处理后生理生化指标及其表型的变化。通过实验得出以下的结论:1.通过检测在120mmol/LNaCl胁迫和5mmol/LNaHCO3胁迫下种子萌发率,叶片、根长、以及鲜重,我们发现AtSRT2组的拟南芥在不同的胁迫处理条件下,萌发率都能达到100%,相反atsrt2表现为萌发较晚甚至不萌发,5mmol/LNaHCO3胁迫下萌发率最低,在75%左右;120mmol/LNaCl下AtSRT2组的根长为3.22cm,约是WT组、pGWB2组、atsrt2组的1.25倍、1.19倍、1.56倍,5mmol/LNaHCO3下根长为2.94cm,约是其它三组的1.35倍、1,28倍、1.64倍;此外,叶片大小和鲜重也都大于其他三组,120mmol/L NaCl下,AtSRT2组的鲜重为37.9mg,约是WT组、pGWB2组、atsrt2组1.22倍、1.26倍、1.79倍,5mmol/L NaHCO3 AtSRT2组的鲜重为32.1mg,约是WT组、pGWB2组、atsrt2组的1.53倍、1.39倍、1.80倍。2.通过0、60、120、180mmol/LNaCl溶液和0、3、5、7mmol/LNaHCO3溶液胁迫处理四组拟南芥,发现对照组的四组拟南芥中的渗透调节物质脯氨酸、可溶性蛋白的含量含量无明显的差别,然而随着盐碱浓度的升高,脯氨酸和可溶性蛋白含量呈上升的趋势。在180mmol/LNaCl时达到最大值,AtSRT2组脯氨酸的含量比WT组、pGWB2组、atsrt2组高18.6%、21.1%、34.4%,AtSRT2组可溶性蛋白含量分别比其他三组高了29.8%、28.3%、100%;7mmol/LNaHCO3时含量达到最高,脯氨酸的含量比WT组、pGWB2组、atsrt2组高31.6%、20.8%、45.1%,可溶性蛋白比WT组、pGWB2组、atsrt2高了41.1%、34.5%、73.0%。3.在60mmol/L的NaCl处理时,WT组、pGWB2组、atsrt2组的相对电导率比ATSRT2组高26.3%,10.7%、48.3%;在180mmol/L时,WT组、pGWB2组、atsrt2组的相对电导率比AtSRT2组高8.6%、12.4%、24.9%;在3mmol/LNaHCO3处理下,WT组、pGWB2组、atsrt2组的相对电导率比AtSRT2组高26.1%,18.4%、41.1%,在7mmol/L时,分别比AtSRT2组高了24.0%、21.8%、54.7%。随着盐碱浓度的升高,相对电导率也呈上升的趋势,但是超表达转基因组上升幅度较小,突变组上升幅度最大。4.在60mmol/LNaCl处理时,AtSRT2组分别比WT组、pGWB2组、atsrt2组高4%、6.8%、11.4%,在180mmol/L NaCl处理下,分别比其他三组高了43.8%、31.4%、119%;3mmol/LNaHCO3下AtSRT2组分别比WT组、pGWB2组、atsrt2组高11.6%、8.5%、20.3%,7mmol/L的NaHCO3下,AtSRT2组分别比WT组、pGWB2组、atsrt2组高45.2%、60.7%、104%。叶绿素的含量随着盐碱胁迫浓度的增加,呈下降趋势,但是AtSRT2组的叶绿素含量最高的,野生型和空载体组高于突变体。5.此外,还进一步检测了胁迫对不同拟南芥植株的抗氧化酶的影响,通过测定SOD、POD的酶活力发现,在没有胁迫处理的对照组四组拟南芥的酶活力没有明显的差别,但是SOD、POD酶活随着盐和碱浓度的升高而升高,AtSRT2组的酶活力高于其他三组,突变体酶活力最低,当盐浓度在120mM时,SOD酶活差别最显著,AtSRT2组分别是WT组、pGWB2组、atsrt2组1.38倍、1.30倍、1.53倍,碱浓度在7mM时SOD酶活差别最显著,AtSRT2组分别是WT组、pGWB2组、atsrt2组1.23倍、1.32倍、1.60倍;POD酶活在盐浓度为180mM时差异最明显,AtSRT2组分别是WT组、pGWB2组、atsrt2组1.32、1.26、1.67倍,碱浓度达到7mM最显著,AtSRT2组分别是WT组、pGWB2组、atsrt2组1.23、1.32、1.37倍。通过上述研究,我们对AtSRT2基因的功能以及与非生物胁迫的关系有了更深的认识,为以后更加深入研究该基因的作用机制以及如何参与非生物胁迫应答的提供一些依据,这对非生物胁迫下提高植物耐逆能力具有重要意义。