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研究目的：吸烟是公认的肺癌发生重要危险因素,对肺癌的影响不仅仅限于引起肺癌的发生,而且对肺癌的预后及治疗效果也有着十分重要的影响,特别在肺腺癌患者中,如患者继续吸烟其存活率较戒烟或不吸烟者更差,然而其分子机制尚不清楚。香烟烟雾中有害物质不但可作用支气管肺上皮细胞诱导其癌变,而且还能通过继续刺激肺癌细胞,造成肺癌细胞中基因结构及表达发生改变,这些基因表达的变化势必影响肺癌细胞蛋白质组学的改变,从而进一步影响肺癌细胞的生物学特性。已有的研究多集中在香烟烟雾造成肺癌患者单一或少数几个基因表达的差异上,近几年蛋白质组学技术继续的发展为探索香烟烟雾中有害物质诱导肺癌进展的分子机制提供了很好的技术平台,目前香烟烟雾中有害物质诱导肺癌进展的蛋白组学变化的研究甚少。本研究通过香烟烟雾提取物及其主要的致癌物苯并芘模拟吸烟体外处理人肺腺癌A549细胞,应用蛋白质组学技术研究香烟烟雾及其致癌物苯并芘诱导肺癌患者进展的分子机制。第一章苯并芘诱导人肺腺癌A549细胞相关分子改变的比较蛋白质组学研究研究方法：使用0.1μM苯并(a)芘(Benzo(a)Pyrene, B(a)P)处理A549细胞72h,检测各组细胞中的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平及脂质过氧化(lipid peroxidation, LPO)水平。应用二维凝胶电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)分离B(a)P处理组(B(a)P-A549)、对照组(DMSO-A549)的总蛋白质,图像分析识别差异表达的蛋白质点,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,Western blot验证差异蛋白heat shock protein 27(HSP27)以及Mn superoxide dismutase (Mn SOD)的表达。使用0.1μM、1μM、10μMB(a)P处理A549细胞后,应用Western blot及RT-PCR检测各组细胞中MnSOD的表达,检测各组细胞中总抗氧化活性(total antioxidant capacity)、总SOD活性(total activity of SOD)、过氧化氢酶活性(catalase activity, CAT)、谷胱甘肽还原酶活性(glutathione reductase, Gr)。研究结果：研究发现1μM B(a)P可以诱导A549细胞中活性氧水平增高并导致脂质过氧化。采用一步抽提法制备B(a)P-A549及DMSO-A549细胞株的总蛋白质,应用双向凝胶电泳技术建立了重复性和分辨率均较好的的双向凝胶电泳图谱。PDQuest软件对两株细胞蛋白质的双向电泳图谱进行了比较,识别了39个差异表达的蛋白质点。采用MALDI-TOF-MS对差异表达的蛋白质进行分析,获取MALDI-TOF-MS肽质量指纹图谱,数据库搜索鉴定了23个差异表达的蛋白质。Western blot证实HSP27及Mn SOD的表达水平在B(a)P处理组中较对照组明显下调,其结果与比较蛋白质组学研究的结果一致；使用0.1μM、1μM、10μMB(a)P处理A549细胞后,发现随着B(a)P的浓度升高,虽然Mn SOD的表达及SOD活性出现先诱导后抑制的现象,但CAT及Gr活性的增高依然提高了机体的总抗氧化活性。研究结论：采用蛋白组学技术分析了香烟烟雾中的致癌物B(a)P对人肺腺癌A549细胞蛋白表达的影响,质谱鉴定了23个差异表达蛋白,其中HSP27及Mn SOD有望成为监测香烟烟雾中B(a)P氧化应激损伤的生物分子标志物；随着B(a)P的浓度升高,Mn SOD的表达及SOD活性出现先诱导后抑制,而CAT及Gr的活性增高提高了机体的总抗氧化活性,CAT及Gr在对抗B(a)P带来的氧化损伤方面可能具有十分重要的作用。第二章香烟烟雾提取物诱导A549细胞相关分子改变的比较蛋白质组学研究研究方法：通过香烟烟雾提取物长期处理A549细胞(16周)以模拟肺癌患者继续吸烟的状态(Current-smoking组),处理16周后换用不含香烟烟雾提取物的普通培养基继续培养8周以模拟肺癌后戒烟的状态(Ex-smoking组),同时使用一直用普通培养基培养的A549细胞以模拟不吸烟肺癌患者的状态(Non-smoking组)作为对照组。提取上述三组细胞的总蛋白,采用蛋白质双向电泳技术和质谱技术分离鉴定差异蛋白质,应用划痕实验及Transwell实验检测三组细胞的转移侵袭能力的变化；应用Western blot及RT-PCR验证部分差异蛋白的表达。研究结果：本研究应用双向凝胶电泳技术建立了重复性和分辨率均较好的Current-smoking组、Ex-smoking组及其对照组Non-smoking组细胞的双向凝胶电泳图谱；PDQuest软件对三株细胞蛋白质的双向电泳图谱进行了比较,发现有19种差异蛋白的表达在去除CSE后8周(Ex-smoking组)中恢复到了对照组(Non-smoking组)的水平,而剩余的21种蛋白的表达在去除CSE后8周(Ex-smoking组)中并没有恢复到对照组(Non-smoking组)的水平。划痕实验及Transwell实验发现CSE处理后的A549细胞(Current-smoking组)侵袭及迁移能力明显比对照组A549细胞增高,且经过脱毒处理8周的Ex-smoking组仍然高于对照组,这说明决定侵袭转移能力增高的差异蛋白在脱毒处理后应该没有回复到对照组的水平。通过生物信息学分析后,本研究选择Nm23-H1、14-3-3σ及vimentin这三种与肿瘤迁移相关的差异蛋白继续研究。Western blot及RT-PCR证实CSE作用A549细胞16周后及脱毒处理8周后,vimentin的表达水平明显增高,而nm23-H1及14-3-36表达水平明显下降。研究结论：本研究采用蛋白质组学技术筛选到40个香烟烟雾诱导A549细胞差异表达的蛋白质,这些差异表达蛋白可能与香烟烟雾诱导肺腺癌细胞转移潜能有关。其中Nm23-H1及14-3-3σ表达下降,vimentin表达上升可能与香烟烟雾诱导A549细胞侵袭及迁移能力明显增高有关。第三章部分差异蛋白与非小细胞肺癌临床病理特征及预后的关系研究方法：采用免疫组化染色检测部分差异蛋白质vimentin、nm23-H1及14-3-3σ在74例肺鳞癌及51例肺腺癌组织中的表达,并分析vimentin、nm23-H1及14-3-3σ表达水平与临床病理特征和患者预后的关系。研究结果：实验显示患者吸烟严重程度与vimentin表达正相关,与nm23-H1及14-3-3σ的表达负相关。vimentin表达与区域淋巴结转移状况呈正相关,14-3-36表达与区域淋巴结转移状况呈负相关,nm23-H1表达与区域淋巴结转移状况呈负相关。Nm23-H1及14-3-3σ表达下调、vimentin表达上调的肺癌患者,生存率明显下降。研究结论：Vimentin、nm23-H1及14-3-36与肺癌的吸烟程度、转移和预后相关,有望成为预测吸烟的非小细胞肺癌患者转移及预后的分子标志物及潜在的治疗靶标。总结：1)采用蛋白组学技术分析了香烟烟雾中的致癌物B(a)P对人肺腺癌A549细胞蛋白表达的影响,质谱鉴定了23个差异表达蛋白,HSP27及Mn SOD有望成为监测香烟烟雾中B(a)P氧化应激损伤的生物分子标志物。2)随着B(a)P的浓度升高,Mn SOD的表达及SOD活性出现先诱导后抑制,而CAT及Gr的活性增高提高了机体的总抗氧化活性,CAT及Gr在对抗B(a)P带来的氧化损伤方面可能具有十分重要的作用。3)采用蛋白组学技术分析了香烟烟雾提取物长期处理及脱毒处理后A549细胞蛋白表达的变化,鉴定了40种差异表达蛋白,这些差异表达蛋白可能与香烟烟雾诱导肺腺癌细胞转移潜能有关。其中Nm23-H1及14-3-3σ表达下降,vimentin表达上升可能与香烟烟雾诱导A549细胞侵袭及迁移能力明显增高有关。4) Vimentin、nm23-H1及14-3-3σ与肺癌的吸烟程度、转移和预后相关,有望成为预测吸烟的非小细胞肺癌患者转移及预后的分子标志物及潜在的治疗靶标。