目的：本课题旨在明确N-cadherin在hDPSCs中的表达和定位，研究N-cadherin对hDPSCs增殖、迁移以及成牙本质向分化的作用，阐明N-cadherin在牙髓组织损伤修复中的作用，同时为牙髓再生提供理论依据。　　方法：1.N-cadherin在人牙髓干细胞中的表达　　收集13-25岁志愿者因正畸或阻生需要而拔除的新鲜无龋损、无牙周病的健康前磨牙或第三磨牙，采用组织块酶消化法体外分离培养hDPSCs;取生长状态良好的hDPSCs，制作细胞爬片，采用免疫细胞化学检测波形丝蛋白和角蛋白的表达，进行细胞来源鉴定;胰酶消化收集生长状态良好的hDPSCs，流式细胞术检测细胞表面标志物;采用含有100 nM地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、10 mMβ-甘油磷酸钠的成牙本质诱导培养基对hDPSCs进行牙本质向分化诱导14 d后，茜素红染色检测矿化结节形成能力;采用含有1μM地塞米松、200μM吲哚美辛、0.5 mM3-异丁基-1甲基黄嘌呤(IBMX)、10μg/mL胰岛素的成脂诱导培养基对hDPSCs进行成脂向分化诱导21 d后，油红O染色检测脂滴形成情况。　　TRIzol法提取hDPSCs总RNA，逆转录聚合酶链式反应(Reverse-transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)检测hDPSCs中N-cadherin mRNA的表达情况;取生长状态良好的hDPSCs，制作细胞爬片，免疫细胞化学检测N-cadherin在hDPSCs中的表达和定位;对hDPSCs进行成牙本质向分化诱导7d和14d，分别提取诱导组和对照组总RNA，实时定量聚合酶链式反应(Real time quantitativepolymerase chain reaction，Real time PCR)检测hDPSCs成牙本质向分化诱导后N-cadherin表达量的变化。　　2.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响制备N-cadherin shRNA慢病毒;根据完全培养基(complete medium，CM)（含100 mL/L FBS的DMEM）、感染增强液(enhanced infection solution，Enis)、MOI(10、25、50)、polybrene(5μg/mL)的不同分为12组，摸索N-cadherin ShRNA慢病毒转染hDPSCs的最佳条件;根据最佳转染条件对P3 hDPSCs进行病毒转染，72 h后倒置荧光显微镜下观察转染效率，并分别提取各组hDPSCs总RNA和总蛋白，Real time PCR和Western blot分别从mRNA和蛋白水平验证抑制N-cadherin表达的效率，构建N-cadherin表达抑制hDPSCs模型。　　对WT组、ShRNA-Ctrl组和ShRNA-N-cad组hDPSCs进行成牙本质向分化诱导后，采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)染色检测ALP活性，茜素红染色检测矿化结节形成能力;此外，采用Real time PCR和Western blot检测成牙本质相关基因ALP、骨钙素(osteocalcin，OCN)、牙本质基质蛋白1(dentinmatrix protein1，DMP1)、牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein，DSPP)的表达和可能信号分子β-catenin的表达，研究抑制N-cadherin表达对hDPSCs成牙本质向分化的影响。　　3.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞增殖和迁移的影响　　将生长状态良好的P3 WT组、ShRNA-Ctrl组与ShRNA-N-cad组hDPSCs接种于96孔板，CCK-8法检测第1-8 d相同时间点450 nm波长处光密度值(optical density, OD)，绘制细胞生长曲线;胰酶消化收集各组hDPSCs，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡，研究N-cadherin表达抑制后hDPSCs的增殖情况。　　分别将5×104个WT组、ShRNA-Ctrl组和ShRNA-N-cad组hDPSCs接种于Transwell小室的上室，其中上室加入无血清培养基200μL，下室加入完全培养基600μL，20 h后观察并分析穿过小孔的细胞数量，检测N-cadherin表达抑制对hDPSCs迁移能力的影响;同时采用Real time PCR检测各组hDPSCs趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)和CXC趋化因子受体4(CXC receptor4，CXCR4)的表达情况。　　结果：1.人牙髓干细胞的培养和鉴定　　实验所分离培养的细胞生长状态良好，呈成纤维细胞样。免疫细胞化学结果显示波形丝蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性，流式细胞术结果显示间充质干细胞表面标志物CD44、CD90、CD29阳性表达率分别为100％、99.9％、94.7％，造血细胞表面标志物CD45、CD31、CD34阳性表达率为分别0.47％、0.13％、0.16％。成牙本质向分化诱导14d后，茜素红染色显示有大量大小不等的红褐色矿化结节形成;成脂向分化诱导21d后，油红O染色显示细胞胞浆内有橘红色脂滴形成。　　2.N-cadherin在人牙髓干细胞中的表达　　RT-PCR结果显示hDPSCs中有N-cadherin mRNA的表达，免疫细胞化学结果显示，N-cadherin在hDPSCs的表达主要定位于细胞膜和细胞质。hDPSCs成牙本质向分化诱导7d和14 d后，诱导组N-eadherin的表达与对照组相比均显著下调。　　3.N-cadherin表达抑制人牙髓干细胞模型的构建　　成功制备N-cadherin ShRNA慢病毒，转染hDPSCs的最佳条件为完全培养基、polybrene5μg/mL、MOI=25。N-cadherin ShRNA慢病毒转染hDPSCs72 h后，倒置荧光显微镜下观察细胞转染效率可达80％以上，Real time PCR和Westernblot结果显示，hDPSCs中N-cadherin mRNA和蛋白水平的表达均受到显著抑制。　　4.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞成牙本质向分化的影响　　成牙本质向分化诱导后，Real time PCR和Western blot结果显示，相对于ShRNA-Ctrl组，ShRNA-N-cad组成牙本质相关基因ALP、OCN、DMP1和DSPP的表达均显著上调，同时β-catenin表达亦明显增加，并且碱性磷酸酶活性和矿化结节形成数量亦显著提高。　　5.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞增殖能力的影响　　CCK-8结果显示ShRNA-N-cad组与ShRNA-Ctrl组相比，细胞增殖活性以第5d为转折点，呈先增高后降低的趋势。流式细胞术结果显示，在第6d，与ShRNA-Ctrl组比较，ShRNA-N-cad组G0/G1期细胞比例显著增加，而S期和G2/M期细胞比例则明显减小，并且ShRNA-N-cad组凋亡细胞比例显著高于ShRNA-Ctrl组。　　6.抑制N-cadherin表达对人牙髓干细胞迁移能力的影响　　Transwell结果显示ShRNA-N-cad组穿过小孔的细胞数量显著多于ShRNA-Ctrl组。Real time PCR结果显示，与ShRNA-Ctrl组相比，ShRNA-N-cad组SDF-1和CXCR4的表达量均显著增加。　　结论：1.成功体外分离培养hDPSCs，其来源于间充质，具有成牙本质向分化和成脂向分化潜能。　　2.hDPSCs中有N-cadherin的表达，并且主要定位于细胞膜和细胞质。　　3.成功构建N-cadherin表达抑制hDPSCs模型。　　4.抑制N-cadherin表达可能通过激活β-catenin信号通路而促进hDPSCs成牙本质向分化。　　5.抑制N-cadherin表达可影响hDPSCs的增殖能力。　　6.抑制N-cadherin表达可能通过上调SDF-1/CXCR4的表达而促进hDPSCs的迁移能力。