山西省辣椒炭疽病病原鉴定及其对常用杀菌剂的敏感性

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由炭疽菌引起的炭疽病是山西省辣椒生产的常见病害之一,严重影响辣椒产量与品质。为明确山西省辣椒炭疽病病原及其对常用杀菌剂的敏感性,本研究从山西省各辣椒种植区(应县、山阴县、定襄县、祁县和长子县)采集辣椒炭疽病病样材料,通过形态学和r DNA-ITS测序分析对其病原菌进行初步鉴定,确定其为炭疽属真菌,并通过多基因联合(ITS、TUB2、ACT、CAL、CHS-1和GAPDH)构建系统发育树明确其分类地位;在此基础上,研究辣椒炭疽菌的生物学特性;并通过ISSR-PCR分子标记技术检测辣椒炭疽菌种内遗传多样性;测定不同地区辣椒炭疽病菌对常用杀菌剂苯醚甲环唑、咪鲜胺和啶氧菌酯的敏感性,以期为山西省辣椒炭疽病的诊断、病原鉴定及有效开展病害防治提供依据。具体研究内容如下:1.通过对田间采集疑似辣椒炭疽病的病害材料进行分离纯化,形态学鉴定(菌落形态、分生孢子、分生孢子梗及分生孢子附着胞等)和r DNA-ITS序列分析鉴定,得到111株辣椒炭疽菌菌株,初步确定为辣椒炭疽菌。2.从111株菌株选取4个典型代表(代表菌株Ⅰ、菌株Ⅱ、菌株Ⅲ、菌株Ⅳ)进行致病力检测。代表菌株Ⅰ、菌株Ⅱ、菌株Ⅲ、菌株Ⅳ均能引起辣椒腐烂且发病症状与炭疽病相同,证明分离得到的菌株均具有致病力。以发病的辣椒果实的典型病斑再次进行病菌分离,得到与典型辣椒炭疽病病原菌培养性状一致的病原菌,结果遵循科赫氏法则,说明分离得到的炭疽菌均为引起辣椒炭疽病的致病菌。3.以Monilochaetes infuscans为外类群,通过最大似然法(Maximum Likelihood Tree,ML),将六条基因按ITS-TUB2-ACT-CAL-CHS-1-GAPDH顺序串联起来,构建多基因系统发育树,将其确定为斯高维尔炭疽菌Colletotrichum scovillei。4.通过对辣椒炭疽菌的生物学特性(生长速率、不同温度、不同光照、不同p H以及不同碳源、氮源)进行测定,结果表明,供试菌株菌丝日生长速率略有不同,但无显著差异(P<0.05),平均日生长速率均介于6.32-8.06 mm/d。供试菌株产孢量差异显著,应县菌株的产孢量明显高于其它地区菌株,定襄县菌株产孢量最低(P<0.05);供试菌株的菌丝较适宜生长温度范围为20-25℃,最适生长温度为25℃(P<0.05)。不同产区的所有菌株均在p H=6-7的培养基上生长最快(P<0.05)。所有菌株在全黑暗培养条件下生长最快;长治菌株在以淀粉为碳源的查式培养基上生长最快,在以棉子糖为碳源的查式培养基上生长最慢;其他地区菌株在以蔗糖为碳源的查式培养基上生长最快;在以麦芽糖为碳源的查式培养基上生长最慢(P<0.05);不同产区的所有菌株均在以酵母浸膏为氮源的查式培养基上生长最快,山阴县、祁县、定襄县和应县菌株在以NH4Cl为氮源的查式培养基上生长最慢,长治菌株在以脯氨酸为氮源的查式培养基上生长最慢(P<0.05)。5.通过筛选出的4条ISSR引物进行ISSR-PCR扩增,共扩增出34条带,多态性条带为33条(出现频率为5%~95%的条带),多态性比例为96.88%。聚类结果表明,山西省辣椒炭疽病菌菌株个体之间具有较高的遗传相似性,但种内仍存在一定的遗传变异;菌株之间的遗传多样性与其地理来源之间无明显的相关性。6.采用菌丝生长速率法测定不同地区C.scocillei对三种常用杀菌剂咪鲜胺、苯醚甲环唑和啶氧菌酯的敏感性。结果表明:C.scocillei对咪鲜胺的EC50值介于0.3328-1.4917μg/m L,平均值为0.8171±0.3283μg/m L,EC50值基本呈连续变化趋势。以Shapiro-Wilk法对38株菌株的敏感性分布进行正态性检验,表明病原菌对咪鲜胺的敏感性呈近似正态分布,未出现敏感性下降的群体。因此,0.8171±0.3283μg/m L可作为辣椒炭疽病菌对咪鲜胺的敏感基线。C.scocillei对苯醚甲环唑的EC50值介于1.1343-5.4064μg/m L,平均值为3.1267±1.2212μg/m L,EC50值基本呈连续变化趋势。以Shapiro-Wilk法对38株菌株的敏感性分布进行正态性检验,表明病原菌对苯醚甲环唑的敏感性呈近似正态分布,未出现敏感性下降的群体。因此3.1267±1.2212μg/m L可作为辣椒炭疽病菌对苯醚甲环唑的敏感基线。C.scocillei对啶氧菌酯的EC50值介于0.0281-3.8737μg/m L,平均值为3.1267±1.2212μg/m L,最大与最小值相差137.8541倍,EC50值基本呈连续变化趋势。以Shapiro-Wilk法对38株菌株的敏感性分布进行正态性检验,病原菌对啶氧菌酯的敏感性呈左偏态,不呈正态分布,疑似出现敏感性下降的群体。其平均值3.1267±1.2212μg/m L不可作为辣椒炭疽病菌对啶氧菌酯的敏感基线。7.对疑似抗性菌株的Cytb基因进行扩增和测序,并与敏感菌株进行比对。结果表明,在疑似抗性菌株中均没有发现已报道的Qo Is相关抗性位点(129、137和143位氨基酸)发生单位点突变。因此,疑似抗性菌株对啶氧菌酯表现敏感性下降,可能是由于菌株旁路氧化途径作用所致。
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