胶原蛋白(collagens)是一类细胞外基质蛋白,是结缔组织的主要蛋白成份,在维护各种组织的结构完整性方面,扮演着重要的角色。胶原蛋白富含多种氨基酸,具有多种独特的结构,有着特异的组织分布,与一些器官的功能有直接的关联,更关系到生物体的衰老。由于人源胶原蛋白的生产与使用存在着伦理与道德的问题。所以本论文根据人III型胶原蛋白三肽功能区序列和合成生物学标准部件设计原则,通过基因工程的方法对嗜热链球菌进行改造,使其高产人III型胶原蛋白肽,从而避免了伦理与道德的问题。本论文通过密码子优化的方法人工设计、优化并合成了542bp的人III型胶原蛋白α1链基因序列(col III),包括了4个酶切位点、组氨酸标签及信号肽序列。将该基因片段连同nis I抗性片段插入线性载体p SB1C3中,构成连接质粒(p SB1C3-col III-nis I)。将连接质粒转入大肠杆菌进行扩增,提取质粒进行双酶切,得到目标片段。将目标片段插入载体p MG36e中,构成重组质粒(p MG36e-col III-nis I)。制备嗜热链球菌感受态,通过电击的方法将质粒转入嗜热链球菌感受态细胞,构建嗜热链球菌工程菌。提取工程菌质粒进行酶切鉴定、PCR产物测序与SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。本论文培养工程菌进行Tricine SDS-PAGE电泳检测分析,从中筛选出蛋白质表达量最高且重组质粒稳定性最好的菌株。筛选最优细胞破碎法对工程菌进行细胞破碎处理,将破碎后冷冻离心的胞外蛋白、胞内蛋白和包涵体蛋白进行Tricine SDS-PAGE电泳检测、Western Blot检测,确认目标胶原蛋白肽表达于胞内与包涵体。大量表达目的胶原蛋白肽并过镍柱纯化,得到高纯度的目标胶原蛋白肽。本论文制备空菌与工程菌的生长曲线,确认工程菌的生长不因基因改造而发生变化。制备菌液OD600下的分光光度值与蛋白质浓度的关系曲线,发现其具有正相关性。根据经济原则与高效原则,优化培养基碳源与氮源、培养温度、红霉素浓度、温度、接菌量,分析得出最佳培养基配比与培养条件。培养基中的碳源和氮源的最佳比例为1%的葡萄糖,2%的蛋白胨和1%的酵母提取物。将菌液按0.4%的接菌量接种于含有2.5mg/m L的红霉素浓度的ELL培养基中,42℃培养,至OD600下的分光光度值为1.5左右,目标胶原肽的表达量最高,约占胞内总蛋白的21.97%。