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背景与目的原发性肝癌是严重威胁人类健康的常见的恶性肿瘤,90%以上的原发性肝癌都为肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)。在中国,HCC居全部癌症发病率中的第2位。全球HCC为癌症死亡率的第一位。HCC的预后较差,即使早期或者肿瘤<3cm行手术切除的病人5年的生存率也只有47%到53%,2年的肿瘤复发率高达55%。随着肿瘤基因组学和蛋白组学的应用研究进展,越来越多的学者更加关注分子水平危险因素对恶性肿瘤转移、复发、生存时间等预后的影响,以期更早制定干预措施,提高肝癌患者生存率。端粒酶是一种逆转录酶,能利用自身RNA为模板从头合成DNA序列,弥补端粒DNA在复制中的丢失,解决末端复制问题,维持端粒长度的稳定,赋予细胞无限增殖的能力。端粒失功能或端粒酶激活是肿瘤发生发展的重要病理机制,端粒酶基因变异有可能参与到这些机制中,促进肿瘤发生或对肿瘤发生起保护作用。因此,可以假设：端粒酶基因变异可能导致端粒酶表达异常、表达调节异常或端粒酶活性异常,进而改变端粒长度与功能,影响肿瘤发展及预后。本研究目的为：通过对HCC患者癌组织样本中端粒酶基因5个SNP位点多态性的分析,探讨这些基因位点变异对肝癌患者手术治疗后转移、复发、死亡结局的影响,为肝癌患者预后分析与干预提供临床应用基础信息。方法1.研究对象的收集与随访：收集昆明医科大学附属甘美医院就诊并病理明确诊断的肝癌患者共84例,收集患者的性别、年龄、肿瘤家族史、乙肝病毒两对半、丙肝病毒抗体、巴塞罗那肝癌分期、治疗措施类型(包括手术切除、酒精注射／射频、化疗栓塞等)等基本信息,电话随访患者的术后转移、复发或死亡等情况,随访时间为2006年7月1日-2015年1月30日。2.选择AS-PCR方法进行HCC组织样本中端粒酶基因5个SNP位点多态性的检测。自主设计引物,组建并优化PCR反应体系及扩增条件,构建出适用于端粒酶基因5个SNP位点多态性检测的10个AS-PCR检测体系,并通过PCR产物测序分析验证其检测结果的正确性。3.用经验证后的AS-PCR方法,对HCC组织样本进行端粒酶基因5个SNP位点基因多态性检测并分析其等位基因和基因型频率的分布规律。4.用COX回归分析方法分析端粒酶基因5个SNP基因与多态性与预后相关性,探讨其在肝细胞性肝癌患者预后中的作用。结果1.84例研究对象中,男性69例,女性15例,平均年龄为49岁,最大为77岁,最小为31岁。获得随访信息的病例有53例；其肝癌组织成功提取DNA病例有59例；既有随访病例也有基因多态性分析的病例有41例,其中,男性33例,女性8例,到随访结束时,出现死亡的病例13例,术后复发5例,转移6例,删失值17例。2.AS-PCR优化结果,最适退火温度分别为：SNP位点rs2735940为53℃,rs2736100为61℃,rs2736098为63℃,rs35719940为62.8℃,rs2293607为66.3℃；采用浓度20μm作为最适引物浓度；选择TaqDNA聚合酶0.25μl(1.25U)为最适酶浓度,成功构建了分别针对野生型引物和突变型引物的AS-PCR反应体系和针对端粒酶基因每个SNP位点引物的退火条件。自主构建的AS-PCR方法对端粒酶基因5个SNP位点多态性检测结果与PCR扩增产物测序分析结果一致3.59例HCC组织成功提取DNA的患者中,其癌组织样本端粒酶基因5个SNP位点基因突变频率在42%-60%之间。野生基因型频率在2.4%-24.2%,杂合基因型占51.2%-97.6%；突变纯合基因型频率为0%-34.2%,其中位点rs2736098和rs35719940没有检测到突变纯合基因型患者。4.到随访截止期,既有随访病例也有基因多态性分析的41例HCC患者平均生存时间为24个月,生存率随着随访时间增加而逐渐下降。COX回归分析结果显示,以死亡为结局时,SNP位点rs2735940基因突变对死亡的回归系数p为2.044,p=0.018(<0.05),具有统计学意义,相对危险度(Exp(B))为7.720,95.0% CI为1.427-41.757。5.端粒酶基因SNP位点rs2735940分别与性别、年龄、家族史、巴塞罗那分期和治疗措施进行两因素COX回归分析,结果显示：①rs2735940位点突变与巴塞罗那分期同时分析时,其回归系数p分别为1.164和0.991,相对危险度(Exp(B))分别为3.204(95.0% CI为0.854-12.022)和2.693(95.0% CI为1.321-5.492),p值分别为0.084和0.006,仅巴塞罗那分期的回归系数p具有统计学意义；②rs2735940与治疗措施同时分析时,其回归系数β分别为1.882和-1.631,相对危险度(Exp(B))分别为3.651(95.0% CI为0.916-14.501)和0.196(95.0% CI为0.054-0.704),p值分别为0.067和0.013,仅治疗措施具有统计学意义。③rs2735940位点突变分别与性别、年龄、家族史的两因素回归分析显示,仅有rs2735940位点突变的回归系数(p分别为5.746、2.656、6.564)的有统计学意义(p值分别为0.010、0.007、0.004),而性别、年龄、家族史回归系数(β分别为0.012、0.977、0.685)的无统计学意义(p值分别为0.695、0.354、0.396)。结论1.本研究中自主构建的端粒酶基因5个SNP位点突变AS-PCR检测方法中引物是可用的,且有特异性的。2.本研究中自主构建的端粒酶基因5个SNP位点突变AS-PCR检测方法,检测结果可靠,经济适用,操作简便,有临床推广应用前景。3端粒酶基因启动子区域rs2735940 3677位点T→C突变增加了患者术后死亡的风险。