虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是一种严格细胞内寄生的微孢子虫,属于壶孢目、肠胞虫科、肠胞虫属,可感染多种经济虾类,大多存在于虾肝胰腺小管上皮细胞。自2001年EHP被发现以来,世界上主要的凡纳滨对虾养殖地区都有虾肝肠胞虫病的报道,但目前仍然缺乏对EHP生活史和感染机制的了解。目前在微孢子虫孢壁中至少发现了7种蛋白,在EHP中已鉴定并报道了一种孢壁蛋白。本论文通过分子生物学和透射电镜对EHP的生活史进行了研究,利用真核生物分泌蛋白预测流程Eu Sec Pred2.0预测EHP全基因组中的分泌蛋白,并对分泌蛋白长度、信号肽长度、切割位点处氨基酸分布等信息及分泌蛋白的功能进行分析。随后,以预测获得的分泌蛋白之一-EhSWP7作为研究对象,分析其序列和结构等特征,然后构建了EhSWP7的原核表达载体,诱导蛋白表达,并用其免疫动物,制备获得了EhSWP7多克隆抗体。通过免疫印迹技术验证获得多克隆抗体的特异性后,利用间接免疫荧光技术对虾肝肠胞虫的EhSWP7定位特征进行研究分析。本文的研究结果总结为以下三个方面:1.虾肝肠胞虫生活史的初步研究经透射电镜观察分析,EHP的生活史可划分为感染期、裂殖增殖期和孢子形成期。本研究还表明,健康的虾可以通过食用患病的肝胰腺组织感染EHP。早期裂殖增殖细胞以独特的电子透明层状包涵体(electron-lucent lamellar inclusions,ELI)为特征,其中大部分会首先进行二分裂,然后是多次核分裂。在孢子形成期开始时,观察到电子致密盘(electron-dense disk,EDD)。孢子形成早期,EDD在细胞质中随机分布,但多次核分裂后,EDD的密度明显增加。随后,发育进入孢子形成晚期,EDD堆叠在一起,融合并拉长,形成一个弧形来包裹细胞核,这个弧形就是极管,它的一端被锚定盘固定,两者构成极管-锚定盘复合物。母孢子的质膜向内凹陷时,致密的分泌物使质膜增厚,这标志着开始凹陷分裂形成孢子母细胞。孢子母细胞包括了一个核、一个螺旋4-5圈的极管、锚定盘和ELI,这些结构重排组装,发育为成熟孢子。在一个肝胰腺细胞内可观察到不同发育阶段的EHP。一些成熟的孢子通过胞吐作用排出。基于以上结果和之前的研究,我们构建了EHP的整个生命周期,为今后EHP的预防和治疗工作提供依据。2.虾肝肠胞虫全基因组分泌蛋白的预测分析利用生物信息学方法筛选EHP全基因组中的分泌蛋白,然后对分泌蛋白和信号肽长度、切割位点处氨基酸组成等信息及分泌蛋白的功能进行统计分析。结果表明,分泌蛋白大部分由30～400个氨基酸组成,信号肽大部分由9～32个氨基酸组成,切割位点附近疏水性氨基酸所占比例最高。通过对信号肽进行基序分析,发现信号肽存在显著基序NV[VT][IK]CA[ED][SA]。对所获蛋白质进行功能注释,发现了多种与微孢子虫黏附侵染、调节细胞周期和免疫反应等相关的关键蛋白。3.EhSWP7的抗体制备及定位分析利用生物信息学方法分析EhSWP7的基因序列特征,结果显示:EhSWP7序列含有一个信号肽,且信号肽附近氨基酸疏水性较高;该蛋白序列中未发现潜在的糖基化位点,但预测到多个磷酸化位点;未预测到已知功能的结构域。通过原核蛋白表达以及纯化获得EhSWP7,免疫动物收集到相应多克隆抗体。免疫印迹实验得出,制备的抗体具有较好的特异性和较高的灵敏度。间接免疫荧光实验结果表明,整个孢壁均有蛋白荧光信号。EhSWP7表达于整个孢壁,表明其可能在黏附宿主细胞、介导入侵方面发挥重要作用。综上所述,本研究构建了EHP的生活史、预测分析了EHP的分泌蛋白并对孢壁蛋白7(EhSWP7)进行了定位分析。本论文研究结果有助于了解EHP侵染宿主细胞的过程,为EHP的预防和治疗工作提供依据。