随着人工授精技术在养猪行业中的大规模普及,猪精液的合理稀释与保存越来越重要。目前运用于猪人工授精的精液通常为常温保存的猪精液。而猪精液随着保存时间的延长,除了自身营养物质逐渐消耗以外,精子内活性氧自由基(ROS)会逐渐累积。过量的ROS会氧化损伤精子的结构和功能,进而导致精液品质的降低。因此,在实践生产中,需要外源添加抗氧化剂提高猪精液的抗氧化能力,进而有效减少过量ROS引起的精子氧化应激反应。褪黑素具有很强的抗氧化作用,是目前已知的最有效的抗氧化物之一,常用于精子的保存。本实验在猪精液的稀释液中添加不同浓度的褪黑素,并运用计算机辅助精子分析系统(CASA)、多功能酶标仪、荧光显微镜、蛋白质免疫印迹等实验技术,检测分析17℃保存条件下精子的活力、质膜完整率、顶体完整率、线粒体膜电位、ATP含量、活性氧含量(ROS)、脂质过氧化损伤(LPO)、总抗氧化能力(T-AOC)、凋亡蛋白的表达情况等,探究褪黑素对猪精液常温保存效果的影响,筛选出最适的添加浓度。主要研究结果如下:1.褪黑素能够改善常温保存精液的保存效果。在猪精液常温保存稀释液中添加0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM的褪黑素,检测常温保存精子的活力、质膜完整率、顶体完整率。实验结果表明0.1μM褪黑素添加组的精子活力、质膜完整率、顶体完整率显著高于对照组(p<0.05)。2.褪黑素在猪精液常温保存中能够发挥抗氧化作用。在猪精液常温保存稀释液中添加0.1μM的褪黑素,检测常温保存精子的线粒体膜电位、ATP含量、活性氧自由基(ROS)水平、脂质过氧化(LPO)损伤水平、精子总抗氧化能力(T-AOC)。实验结果表明添加0.1μM褪黑素能够显著降低精子内氧自由基(ROS)水平、脂质过氧化(LPO)损伤水平(P<0.05),显著提高精子的线粒体膜电位、ATP含量及精子总抗氧化能力(p<0.05),说明褪黑素能通过自身的抗氧化能力对猪精子起到保护作用。此外,褪黑素在猪精液常温保存过程中能够发挥抗凋亡作用,在常温保存稀释液中添加0.1μM褪黑素,能够有效降低凋亡蛋白Cleaved Caspase-3以及Cytochrome C的表达量(p<0.05),使精子的凋亡现象得到缓解。3.在甲萘醌诱导的氧化应激模型实验中,检测精子活力、质膜完整率、线粒体膜电位、ATP含量、精子内活性氧自由基(ROS)水平以及精子总抗氧化能力(T-AOC)。实验结果发现添加0.1μM褪黑素处理后,精子活力、质膜完整率、线粒体膜电位、ATP含量以及精子总抗氧化能力(T-AOC)显著高于甲萘醌处理组(p<0.05),并且精子内活性氧自由基(ROS)水平也显著低于甲萘醌处理组(p<0.05),进一步说明褪黑素能够发挥抗氧化作用而保护猪精子。由以上结论可知:一方面,褪黑素能够发挥抗氧化作用保护常温保存的猪精子,并且其最适添加浓度为0.1μM;另一方面,褪黑素在猪精液的常温保存过程中可能发挥抗凋亡作用。因此,在猪精液常温保存稀释液中添加褪黑素有利于提高精子的品质,延长精液的保存时长。