背景发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome, SFTS)是新发的一种自然疫源性疾病,2009年首次在中国被发现。这种疾病是由一种新发现的布尼亚病毒引起的。2010年,本人的博士指导教师于学杰教授将其分离出来并命名为发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV),简称为发热伴病毒或新布尼亚病毒,其属于布尼亚病毒科白蛉病毒属,是一种分节段的单股负链RNA病毒,基因组包括：L、M和S三个片段。SFTS的病例主要分布于中国中东部的山区、丘陵地带。该病的高发季节主要集中在每年的四到九月,但发病时间亦存在地域性差异。该病主要发病人群是50岁以上的农民,其病死率约为12%～30%。该病以发热、白细胞减少、血小板降低为主要症状,并伴有全身不适、乏力、头痛、肌肉酸痛以及恶心和呕吐等临床表现,严重者出现多器官衰竭致死。病例大部分呈零星的散在分布,也有个别的聚集性病例。已证实,SFTSV可以通过接触病人血液和分泌物感染,存在人与人间的传播。发现至今,关于SFTS的病原、流行特征、临床诊断和治疗的研究均取得定进展。但SFTSV的传播循环模式尚无明确的定论,目前仅局限于对流行区的家畜、啮齿类动物和媒介节肢动物的流行病学调查研究。许多的研究报道,在硬蜱属的长角血蜱、微小牛蜱、龟形花蜱中检测到SFTSV。因长角血蜱是中国的优势蜱种,推测长角血蜱可能是中国地区SFTSV的主要传播媒介和潜在宿主。近年来,各种新发和再发的蜱传疾病对公共卫生安全以及畜牧业的健康发展造成很大威胁。为此,本课题主要研究长角血蜱在SFTSV传播循环模式中的作用,同时对蜱携带的其它病原微生物如无形体和埃立克体进行检测以及蜱传疾病的人群流行病学研究,预测相关病原的潜在致病性,为预防和控制蜱传疾病提供实验依据和理论指导。研究目的1蜱作为SFTSV的宿主研究1.1检测草地未吸血长角血蜱的三个不同生活周期SFTSV的感染率,分析长角血蜱在SFTS传播中的作用。1.2建立实验室SFTSV感染动物模型,探讨SFTSV在长角血蜱中的传播循环模式。2SFTSV的核蛋白(NP)的原核表达拟对SFTSV的核蛋白(NP)的全序列进行原核表达,获取高效表达的重组目的蛋白,用于后续的健康人群的SFTSV抗体检测。3长角血蜱携带无形体和埃立克体的检测检测草地上长角血蜱无形体和埃立克体的携带率,分析无形体和埃立克体的感染对公共卫生造成的潜在危害。4健康人群蜱传疾病的流行病学调查分析蓬莱市健康人群蜱传疾病(SFTSV、无形体)的抗体水平情况,掌握其抗体动态变化趋势,以期进一步提高对该类疾病的认识,为疫情控制提供流行病学依据。研究方法12013.5～2013.7和2015.5分别在山东胶南和浙江岱山运用布旗法采集野外草地游离未吸血蜱。2运用RT-PCR和PCR对草地上长角血蜱携带的病原体进行检测,扩增的阳性产物进行克隆转化测序,并用Clustal X2.1、MegaAlign、Mega6.0软件建立系统发育树进行核苷酸、核苷酸序列比对和系统进化分析。3运用实时荧光定量PCR监测染毒昆明小鼠一周内SFTSV病毒载量的变化趋势。4运用空斑形成单位法检测培养收获的病毒滴度。5采用酶联免疫吸附实验(ELISA)和间接免疫荧光实验(IFA)检测染毒昆明小鼠SFTSV抗体水平。6运用PCR法扩增SFTSV NP基因,并克隆至pET32a载体,构建原核表达载体pET32a-NP,经酶切、测序鉴定后转化表达菌BL21(DE3),再经诱导、纯化得到pET32a-NP融合蛋白,采用Western Blot验证融合蛋白pET32a -NP的抗原性。72015.11～2016.1在山东省蓬莱市小门家、大柳行、大辛店三个乡镇六个行政村运用多阶段单纯随机抽样抽样方法,采集健康人群血清628份,采用ELISA检测健康人群血清中无形体和SFTSV抗体。研究结果1.长角血蜱作为新布尼亚病毒的传播媒介、宿主的研究结果1.1 蜱标本SFTSV检测结果本课题组在山东胶南草地共采集蜱3,300只,其中幼蜱120只,稚蜱1,620只,成蜱1,560只。经过形态学鉴定和16S rRNA基因分子生物学鉴定,草地上采集到的蜱标本主要是长角血蜱。本次研究山东胶南草地上长角血蜱共有8管SFTSV阳性,以最小感染率计算长角血蜱SFTSV的总感染率为0.2%,幼蜱、稚蜱、成蜱的SFTSV感染率分别为0 (0/120)、0.12% (2/1,620),0.39%(6/1,560)。这一研究表明未吸血长角血蜱可以携带SFTSV。1.2不同时期长角血蜱叮咬染毒小鼠后,长角血蜱SFTSV的感染情况正常幼蜱叮咬染毒小鼠,运用RT-PCR检测饱血后长角血蜱SFTSV的阳性率为18%(9/50),蜕皮进化成稚蜱SFTSV的阳性率为11.7%(14/120)。正常稚蜱叮咬染毒小鼠,运用RT-PCR检测饱血后长角血蜱稚蜱SFTSV的阳性率为20%(2/10),蜕皮进化成成蜱时SFTSV的阳性率为11.7%(14/120)。13只正常成蜱叮咬染毒小鼠,运用RT-PCR检测饱血后成蜱SFTSV的阳性率为46.2%(6/13),产卵孵化成幼蜱时SFTSV的阳性率为53.8%(7/13)。这一研究,表明蜱能经卵和经期传播SFTSV,蜱是SFTSV的自然宿主。1.3不同时期染毒长角血蜱叮咬正常小鼠后,小鼠SFTSV的感染情况染毒稚蜱叮咬正常小鼠后,小鼠SFTSV的感染率为40%(4/10)；染毒成蜱叮咬正常小鼠,小鼠SFTSV的感染率为20%(2/10),RT-PCR结果与小鼠SFTSV抗体结果一致。这一研究表明,蜱可以从感染动物获得SFTSV并能传播SFTSV给动物,说明蜱是SFTSV的传播媒介。2.草地游离蜱携带埃立克体和无形体检测结果2.1蜱标本埃立克体和无形体的检测结果浙江岱山草地共采集蜱标本780只,其中幼蜱0只,稚蜱630只,成蜱150只。用埃立克体的16S rRNA、gltA和groEL基因特异性引物进行巢氏PCR检测,以最小感染率计算浙江岱山长角血蜱埃立克体的感染率为0.4%(3/780),3管均为稚蜱。山东的蜱标本中未检测出埃立克体。DNA序列分析显示,来自长角血蜱中的埃立克体与Ehrlichia种属的16S rRNA同源性为98.3%～99.8%,与E. ewingii的同源性最高。核苷酸序列同源性分析显示groEL和gltA基因的同源性分别为89.6%～93.8%和68.5%～90.4%,与E. ewingii是在一个分支上。随机抽取山东胶南蜱标本1,680只,其中幼蜱120只,稚蜱1,200只,成蜱360只。用无形体16S rRNA基因特异性引物进行巢氏PCR检测,以最小感染率计算山东胶南长角血蜱无形体的感染率为0.18(3/1,680),其中两管稚蜱,一管成蜱,无形体的感染率分别为0.17%(2/1,200)和0.28%(1/360)。浙江岱山的蜱标本中未检测出无形体。核苷酸序列同源性分析显示来自山东长角血蜱中的16SrRNA与无形体种属的同源性为99.0%～99.5%。3.蜱传疾病的人群血清流行病学研究3.1成功构建了pET32a-NP融合蛋白原核表达载体0.5mM IPTG,诱导10 h,重组目的蛋白pET32a-NP在BL21细菌中获得高效表达。电泳分析表明目的蛋白以包涵体表达为主,纯化后的pET32a-NP融合蛋白具有良好的抗原性。将纯化复性后的pET32a-NP融合蛋白作为抗原包被ELISA板,每孔300 ng,用于后续健康人群SFTSV抗体检测。3.2蓬莱市健康人群血清流行病学研究3.2.1 SFTSV总阳性率共检测血清标本628份,其中无形体阳性血清22份,阳性率为3.5%(22/628)；SFTSV阳性血清33份,阳性率为5.25%(33/628)。3.2.2无形体抗体检出情况三个不同乡镇正常人群无形体抗体阳性率分别为2.84%(6/211),3.85%(8/208)和3.83%(8/209)。其中,男性无形体抗体阳性率为3.45%(11/319),女性无形体抗体阳性率为3.56%(11/309)；青壮年、中年、老年三个不同年龄组无形体抗体阳性率分别为4.73%(10/211)、4.12%(11/267)和0.67%(1/150)。农民、工人及其他无形体抗体阳性率分别为4.37%(20/458),1.32%(1/76),1.06%(1/94)。经卡方检验,不同乡镇、性别、职业之间无形体抗体阳性率没有统计学差异(p>0.1)。不同年龄之间无形体抗体阳性率有统计学差异(p<0.1)。3.2.3 SFTSV抗体检出情况三个不同乡镇正常人群SFTS抗体阳性率分别为5.69%(12/211),5.29%(11/208)和4.78%(10/209)。青壮年、中年、老年三个不同年龄组SFTS抗体阳性率分别为3.32%(7/211),7.49%(20/267)和4%(6/150)。男性SFTS抗体阳性率为4.39%(14/319),女性SFTS抗体阳性率为6.15%(19/309)。农民、工人及其他人SFTS抗体阳性率为6.55%(30/458),1.32%(1/76),2.13%(2/94)。经卡方检验,不同乡镇、性别之间SFTS抗体阳性率没有统计学差异(p>0.1)。不同年龄、职业人群SFTS抗体阳性率有统计学差异(p<0.1)。研究结论及意义1.草地未吸血长角血蜱可携带SFTSV.无形体和埃立克体,说明长角血蜱是这些病原菌的和病毒的自然宿主。2.不同时期的长角血蜱叮咬染毒小鼠后,运用RT-PCR检测饱血和蜕皮后的长角血蜱SFTSV的阳性率,证实SFTSV在长角血蜱体内能经期传播；成蜱叮咬染毒小鼠后,运用RT-PCR检测饱血的成蜱阳性,产卵后幼蜱阳性,证实SFTSV在长角血蜱体内存在经卵传播。这一试验证明长角血蜱是SFTSV的储存宿主。3. RT-PCR检测证明长角血蜱能够从染毒小鼠获得SFTSV,也能将SFTSV传播给小鼠,证明蜱是SFTSV的传播媒介。4.蓬莱市健康人群中SFTSV和无形体抗体阳性率较高,提示蓬莱市存在SFTSV和无形体的流行及隐性感染。不同职业的人群的感染率不同,这主要是因为不同人群与蜱接触机会不同,我们需加强易感人群对无形体和SFTSV感染的的预防意识,提高疾病防控部门对无形体病和SFTS的快速诊断能力。