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疾病的暴发给人类带来了巨大的灾难,已经成为人类生存的最大威胁之一。因此能够快速、准确、灵敏地检测疾病并让患者得到有效治疗,对人类健康非常重要。临床诊断常用的策略主要依赖于病原体的培养和鉴定,或检测病原体的特异性抗原、抗体或核酸。但目前常规的诊断方法如通过观察培养物的特征来鉴定微生物、酶联免疫吸附试验和核酸扩增检测,均需在医学实验室中进行,由于其费时、费工、成本高、昂贵的机器依赖性等而无法实现快速的现场检测,所以应用受到一些限制。近年来,随着临床医学特别是资源贫乏地区对现场检测的需求越来越高,即时诊断（point-of-care testing,POCT）技术自出现以来就越来越受到人们的重视,基于生物传感器的诊断技术也不断发展。因此开发新的诊断方法以加强对这些疾病的及时认识和干预非常重要。本论文通过缩小非细胞体系反应体积,优化非细胞体系组成和体系反应条件,建立一种依赖于β-半乳糖苷酶水解底物氯酚红-β-吡喃半乳糖苷（Chlorophenolred-β-D-galactopyranoside,CPRG）的非细胞显色体系,并结合核酸序列依赖性扩增技术（Nuclear acid sequence-based amplification,NASBA）和toehold switch传感器建立一种简便、低成本、可用于检测病原微生物的方法,并通过食源性病原微生物检测进行方法的验证。本论文首先通过优化非细胞体系组成,初步建立一种依赖于β-半乳糖苷酶水解底物CPRG的非细胞显色体系。该非细胞体系选用Rosetta（DE3）?lac Z抽提物,不需额外添加T7 RNA聚合酶,只需添加磷酸烯醇式丙酮酸提供能量即可,且最佳镁离子浓度为7 m M。该非细胞检测体系的反应温度范围较广（25°C～42°C均可）,静置反应60 min即可。在不同的储存条件下可选择不同的保护剂来提高体系的稳定性,比如在4°C下添加0.05 M海藻糖体系更加稳定,在-20°C下添加1%聚乙烯醇体系更加稳定。在建立的非细胞显色体系基础上,通过比较常见不同孔径大小的定量滤纸、不同孔径大小的定性滤纸和whatman滤纸上嵌入的非细胞显色体系的稳定性,发现嵌入在快速定量滤纸上的非细胞体系稳定性最好。利用生物信息学分析方法和NUPACK软件,并经体内外筛选验证得到针对GII.4型诺如病毒和GII.17型诺如病毒检测的GII.4-SN8和GII.17-SN24两个toehold switch元件,且其特异性良好;经NASBA反应后,在纸基上用GII.4-SN8传感器检测只需500 f M的靶标RNA,用GII.17-SN24传感器检测只需2.6f M的靶标RNA。因此建立了一种基于toehold switch传感器的纸基非细胞体系检测平台,以检测和区分GII.4型和GII.17型诺如病毒。为提高后续检测的灵敏度,针对NASBA体系进行优化。NASBA体系中牛血清白蛋白、二甲基亚砜和山梨醇对后面的非细胞显色体系无影响,且NASBA体系中最优镁离子浓度为15 m M、最佳二甲基亚砜添加量为1.5μL和最佳反应时间为150 min。对非细胞体系冻干条件的研究发现,将细胞抽提物和镁离子混合后与其余混合液分开冻干效果较好;在最佳镁离子浓度条件下,冻干前后镁离子添加量的不同对整体显色无影响。经NUPACK软件分析和非细胞体系实验筛选验证,最终得到针对轮状病毒检测的Ro V-S4元件、针对甲型肝炎病毒检测的HAV-S3元件和针对人星状病毒检测的HAst V-S3元件,且具有高度特异性。384孔板中敏感性检测结果显示,肉眼可观察的检测轮状病毒、甲型肝炎病毒和人星状病毒的下限分别为1.4 f M、14 a M和20 f M。上述检测靶标均为RNA,为扩大检测靶标至DNA,以菌液作为NASBA扩增模板反应时,增加一个简单的4个循环数的聚合酶链式反应就可以扩增得到明显的目的条带。根据单核细胞增生李斯特菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌的特异基因序列,利用NUPACK软件分析和体外筛选验证,分别筛选得到LM-S4、SE-S5、SA-S1和VP-S1四个toehold switch元件。敏感性检测结果显示,对于单核细胞增生李斯特菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌,肉眼可观察到的下限分别为10~5 CFU/m L、10~4 CFU/m L、10~6 CFU/m L和10~6 CFU/m L。特异性检测结果显示,筛选得到的四种病原菌的toehold switch元件具有较好的特异性。综上,本文开发了一种基于NASBA、toehold switch传感器和非细胞体系的核酸检测平台。该平台检测RNA靶标可达a M水平,检测菌液DNA靶标可达10~4 CFU/m L,不需昂贵的仪器和专业的技术人员,为POCT的发展与应用提供了新思路。