论文部分内容阅读
第一部分:替莫唑胺诱导的人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ的建立目的脑胶质瘤单纯手术难以根治,作为新一代化疗药替莫唑胺(TMZ)有良好的抗胶质瘤活性,但在临床实践中表明,耐药性的产生限制了TMZ药物的化疗效果,是造成胶质瘤化疗失败的主要原因,因此在体外建立对TMZ耐药的胶质瘤细胞株,对于探讨胶质瘤耐药的分子机制以及逆转胶质瘤耐药的有效策略,提高胶质瘤的化疗效果有重大意义。方法首先利用RT-PCR检测U251细胞中MGMTmRNA的基础表达水平作为进一步实验的依据。采用体外分步诱导法使U251细胞对TMZ产生耐药性;采用细胞集落法确定U251/TMZ的耐药性;MTT法检测TMZ对U251/TMZ细胞毒作用,由回归方程求出半数抑制浓度,进而得出U251/TMZ的耐药指数;分析研究U251/TMZ细胞和U251细胞的耐药关系。结果RT-PCR检测在U251细胞中未检测到MGMT mRNA的表达;模拟临床替莫唑胺的用药程序,通过体外分步诱导法成功地建立了对TMZ具有稳定耐药性的U251/TMZ细胞株。在20.61～164.86mM TMZ培养液中,细胞集落形成相对率显示,U251/TMZ-6细胞形成相对率是未诱导组U251细胞的4～11倍; MTT法检测显示,U251/TMZ对TMZ的耐药指数显示出约4倍的耐药。结论成功建立了一株由TMZ诱导的人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ,分阶段适度递增化疗药物浓度是使U251细胞顺利产生相对耐药性的重要环节。第二部分:MGMT抑制剂O6-BG对U251/TMZ胶质瘤细胞株耐药性的逆转研究目的替莫唑胺是治疗脑胶质瘤最有效的药物之一,但抗药性的产生限制了临床效果。研究表明DNA修复蛋白MGMT是肿瘤细胞对TMZ等烷化剂耐药的主要分子机制。本实验拟通过MGMT酶抑制剂O6-BG联合TMZ用药,探索提高TMZ对胶质瘤化疗效果的新途径。方法采用我们成功建立的由TMZ诱导的人脑胶质瘤耐药细胞株U251/TMZ及其亲本细胞U251,实验分成四组:1):空白对照组;2):O6-BG组;3):TMZ组;4)O6-BG+TMZ组;采用MTT法测定各细胞组对TMZ的细胞毒实验作用影响。结果O6-BG能使TMZ对U251/TMZ细胞敏感性提高3.1倍,而对U251细胞无增敏作用,10μM O6-BG预处理2小时即能明显抑制MGMT活性, 50μM以上时能完全抑制MGMT活性。O6-BG毒性极低,50μM时细胞生存率高于95%。结论O6-BG通过抑制耐药细胞内MGMT的活性,能逆转U251/TMZ对TMZ的耐药性,可望作为化疗增敏剂与TMZ联合使用。第三部分:应用cDNA芯片技术对U251胶质瘤细胞株继发性耐药相关基因的筛查目的替莫唑胺目前作为一线化疗药物在临床推广应用,是治疗脑胶质瘤的重要方法之一,但临床上相当一部分脑胶质瘤患者化疗效果不理想,除胶质瘤原发性耐药外,继发性耐药也是化疗失败的重要原因之一,为了能从多方面全面探讨胶质瘤耐药的分子机制,应用人类cDNA表达谱芯片检测对替莫唑胺耐药和敏感的细胞基因表达的变化,并进行耐药相关基因初步筛选,为进一步研究胶质瘤耐药的分子机制和治疗靶点提供实验依据。方法应用Agilent人类全基因组寡聚DNA芯片技术检测耐药细胞株与亲代细胞基因表达谱的变化,筛选TMZ诱导的继发性耐药基因,通过DAVID生物信息学数据库进行功能聚类分析,筛查耐药相关基因。结果成功建立U251/TMZ细胞株继发性耐药差异基因表达谱,差异表达≥5.0的基因556个,DAVID生物信息学数据库功能聚类分析筛选出胶质瘤继发性耐药相关基因22个。结论通过Agilent人类全基因组寡聚DNA芯片检测初步筛选到ABCB4、SERPINB9、RHAG、CACNA2D1等22个继发性耐药相关基因,为进一步研究肿瘤耐药性的基因机制奠定了基础。ABC转运蛋白基因的高表达在胶质瘤细胞的继发性耐药机制中起着关键作用。