秀丽隐杆线虫学名为Caenorhabditis elegans，简称C.elegans，属于线形动物门、线虫纲动物。秀丽隐杆线虫本身在自然状态下与人类的关系不大，它生活在世界各地的泥土中，以细菌为食，容易人工养殖，对人、动物和植物没有危害。秀丽隐杆线虫成虫长1mm左右，全身透明，研究者很容易在显微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察。秀丽隐杆线虫作为一种模式生物，已广泛应用于寄生性线虫基因功能的研究以及寄生性线虫疫苗候选抗原基因的表达，但在我国这方面的研究起步相对较晚。本研究通过秀丽隐杆线虫体培养特性、Actin—1启动子基因的克隆、表达载体的构建及绿色荧光蛋白(GFP)表达，建立秀丽隐杆线虫表达系统，为进一步表达寄生虫抗原提供良好的技术平台。　　 本实验对秀丽隐杆线虫形态、培养条件以及保存方面进行了研究。将同量秀丽隐杆线虫分别接种于涂有大肠杆菌(OP50)的NGM培养基、LB培养基、LB+胆固醇培养基上，16℃培养72h后，肉眼可见有大量虫体在NGM培养基表面蠕动，镜检有大量大小不同的幼虫，说明NGM培养基比较适合虫体生长。　　 把同量秀丽隐杆线虫接种于涂有大肠杆菌(OP50)NGM培养基中，分别置4℃、16℃和37℃生化培养箱内培养72h，观察虫体的生长发育情况，结果表明，16℃培养条件下虫体生长发育良好，可见大量成虫和幼虫。同时把秀丽隐杆线虫虫卵接种于涂有大肠杆菌(OP50)NGM培养基中，置16℃生化培养箱内培养72h，观察虫体的生长发育情况；结果发现，3天后观察到有虫体孵化出来，虫体大小相近且生长良好，这样可以获得符合试验要求的同期虫体。　　 将欲保存的虫体分别置于10％的二甲基亚砜、10％的甘油(S缓冲液溶解)、30％的甘油(S缓冲液溶解)、不加任何物质直接放入—80℃冻存，保存两个月后取出虫体，解冻后镜检和培养发现，30％甘油溶液—80℃冰箱中保存虫体是比较方便可行的保存方法。　　 把培养的虫体置普通显微镜下观察，雌雄同体成虫长1mm左右，它通身透明，头部较粗尾端较细，在固体培养基表面蠕动缓慢，但在液体中运动较快。在激光共聚焦显微镜下观察，发现虫体肠道部位可发出自发性荧光，且随着虫龄的增加自发性荧光由黄绿色变为黄色。　　 为获取秀丽隐杆线虫特异性表达肌动蛋白启动子，我们参照己发表的秀丽隐杆线虫Act—1基因序列设计引物，以秀丽隐杆线虫基因绢DNA为模板.进行PCR扩增，电泳检测发现扩增出的特异性DNA条带长度略小于300 bp。将PCR产物与pUCm—T载体连接后，转化至DH5α感受态细胞，筛选出阳性克隆。对质粒进行SalⅠ、HindⅢ双酶切和PCR鉴定，对鉴定正确的克隆进行测序。序列分析表明，Act—1启动子基因其序列高度保守，与Genebank报道的序列一致，且包含真核细胞基因启动子的一些分散的保守序列，如TATA框、GATA框、CACCC框、AP1、CAAT框和多个GC框等，其中CAAT框和GC框均属于上游控制元件，但没有发现在原核生物中比较常见的—35序列、SP1等重要序列。　　 为了实现秀丽隐杆线虫肌动蛋白(Act—1)启动子指导外源基因在特定组织中特异性表达，pEGFP—N1真核表达载体经AseⅠ和NheⅠ双酶切去掉CMV启动子序列，补平自连成载体pEGFP—4.1(4.1kb)。利用PCR扩增时设计的HindⅢ酶切位点和T载体多克隆位点中的XhoⅠ，将秀丽隐杆线虫的Act—1启动子序列克隆入同样经过HindⅢ和XhoⅠ作用后的pEGFP—4.1载体上。所构建的载体命名为pAct—EGFP，总长约为4.4kb。连接筛选阳性克隆，并进行酶切鉴定。同时，我们利用双酶切方式将Act—1启动子序列克隆入同样经过双酶切作用后的pEGFP—N1载体上，构建了含CMV和Act—1的双启动子真核表达载体pCMV—Act—EGFP。　　 为了探讨单启动子和双启动子表达载体在秀丽隐杆线虫中的GFP表达效果，将上述构建好的两种高浓度质粒与秀丽隐杆线虫混匀后浸泡，即采用RNAi by soaking的方法，同时设立对照，通过激光共聚焦显微镜观察发现，培养48h试验组虫体有特异性绿色荧光且亮度较强，表明有GFP的表达；培养72h后虫体荧光亮度仍然很亮。GFP主要集中在虫体的皮层、副皮层中，虫体前端尤为明显。与单启动子比较，发现含有两个启动子元件的试验组荧光强度更强一些，说明采用双启动子可以提高目的基因的表达效率。　　 为了比较不同转化方式对秀丽隐杆线虫表达EGFP的影响，将pBluescriptSK+表达载体和pcDNA—EGFP载体上的EGFP序列分别经Bam HI和NotⅠ双酶切，连接筛选阳性克隆，并进行酶切鉴定构成pB—EGFP表达载体。pB—EGFP表达载体和T载体上的Act—1启动子序列分别经PstⅠ和SalⅠ双酶切，连接筛选阳性克隆，进行酶切鉴定正确后构建成pB—Act—EGFP真核表达载体。将该载体通过两种方式导入虫体：一为电转化至沙门氏菌中，通过减毒沙门氏菌携带该载体侵染秀丽隐杆线虫；另一为通过电穿孔法来进行表达。　　 荧光显微镜观察发现，两组虫体培养24h后绿色荧光亮度较弱，培养48h虫体特异性绿色荧光亮度较强.表明有EGFP的表达；但在培养72h后发现，重组沙门氏菌转染组荧光亮度仍然强度很大；而电穿孔组虫体荧光亮度减弱。在表达部位上两种转化方式存在明显差异，重组沙门氏菌转染组GFP主要集中在虫体的咽部及胃肠道，而电穿孔组GFP主要集中在虫体的皮层和副皮层。　　 真核表达载体成功构建以及绿色荧光蛋白基因的表达，将为进一步研究寄生虫功能基因在秀丽隐杆线虫中表达奠定了基础。